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SuperScript III Reverse Transcriptase: SuperScript Reverse Transcriptase의 진화
SuperScript® III Reverse Transcriptase(RT)는 높은 열 안정성(50°C에서 반감기가 길어짐)과 감소된 RNase H 활성을 갖도록 가공되어 보다 완전한 유전자 산물을 표현할 수 있도록 full-length cDNA 수율이 높아집니다. real time RT-PCR에서 최대 정확도와 최고 민감도로 주입 RNA를 표현하는 cDNA가 필요할 경우, SuperScript® III RT가 있어야 합니다.
수천 건이 넘는 참조문헌과 인용을 기록하고 있는 SuperScript® 역전사효소(RT) 제품군은 cDNA 합성에 널리 사용되는 효소 브랜드입니다. 이 브랜드의 역전사효소는 full-length cDNA의 높은 수율을 안정적으로 보여줍니다. 계속해서 증가하는 민감도 요구에 부합하기 위해 SuperScript® III RT는 높은 수준의 열 안정성과 50°C에서 길어진 유효기간을 갖도록 제조되었습니다.
그림 1. SuperScript® III 역전사효소의 성능 진화. SuperScript® III RT는 real-time RT-PCR, 마이크로어레이 실험 등 유전자 발현 어플리케이션에서 최고의 민감도를 제공하기 위해 개발되었습니다.
중합효소 활성 외에도, 역전사효소는 RNA/DNA 하이브리드에서 RNA를 분해할 수 있는 RNase H 활성을 갖습니다. 하지만, 안타깝게도 이것은 in vitro 방식으로 mRNA에서 cDNA를 합성하는 데 방해가 됩니다. 또한, RNase H 활성은 중합 반응을 진행할 때 RNA 템플릿을 가수분해하여 cDNA의 수율과 크기를 감소시킵니다.
RNase H 활성을 제거하면 full-length cDNA의 수율이 높아집니다. SuperScript® III RT는 RNase H 활성을 knockout하는 돌연변이를 포함하도록 가공되었습니다. SuperScript® III가 353bp의 cDNA를 12.3kb로 증폭할 수 있다는 사실이 그림 2에 잘 나와 있습니다.
그림 2. SuperScript® III RT는 full-length cDNA의 수율을 높여 줍니다. SuperScript III RT는 353bp를 12.3 kb cDNA로 증폭하는 데 사용되었습니다. amplicon이 커질수록 1µg의 RNA가 필요한데, 그 이유는 저밀도 full-length RNA와 긴 전사물을 통해서는 판독이 어렵기 때문인 것으로 보입니다.
RNA 전사체는 대개 효율적인 역전사를 위해 반드시 변성되어야 하는 중요한 이차 구조물을 나타냅니다. 온도가 높을수록 RNA는 구조가 약해지지만, 일반적인 역전사효소(MuLV 및 AMV 등)도 45°C 이상의 온도에서 비활성화됩니다. SuperScript® III RT는 높은 열 안정성을 갖고 50°C에서 반감기는 220분입니다. 이것은 이차 구조를 갖는 RNA 공정 기능을 강화해 줍니다(그림 3).
역전사효소 | 50°C에서의 반감기(분) |
|---|---|
| SuperScript ||| | 220 |
| Invitrogen™ SuperScript™ || | 6.1 |
| M-MLV | 3.5 |
그림 3. (위) SuperScript® III RT의 열 안정성. SuperScript? III RT는 MMLV나 SuperScript® II RT보다 열안정성이 현저히 뛰어납니다. 예를 들어 55°C에서 MMLV와 SuperScript® II RT 모두 5분 후 비활성화되었으나 SuperScript® III RT는 10분 후에도 80%의 활성을 유지합니다.
그림 4는 MMLV와 SuperScript® II RT가 온도 증가에 따라 cDNA를 생성하는 데 어려움이 있다는 것을 보여줍니다. 그렇지만, SuperScript® III RT는 55°C에서 활성 상태에 있고 9.5kb 분절 등 최고 수율의 full-length cDNA를 생성할 수 있습니다..
이상적인 역전사효소는 풀(pool) 내에서 최소 밀도의 mRNA라도 역전사하여 단일 세포 전사물을 검출할 수 있습니다. SuperScript® III RT의 높은 민감도는 다양한 크기의 표적으로 잘 나타나 있습니다(그림 5).
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그림 5. SuperScript® III RT의 높은 민감도.(A) SuperScript® III RT는 0.1pg의 전사물 샘플(β-actin 354 및 glyceraldehye-3-phosphate dehydrogenase[GAPDH] 등)로 신호를 쉽게 확보할 수 있습니다. (B) 또한, SuperScript® III RT는 단일 HeLa 세포에서 PCR 증폭을 위해 cDNA를 생성할 수도 있습니다.
위에 나온 데이터는 유전자 발현 분석을 위한 고품질 역전사효소로서 SuperScript® III 역전사효소 사용이 적합함을 뒷받침해 줍니다. 그렇다면, 경쟁 제품을 어떻게 앞서 나가고 있을까요? 당사는 인기 역전사효소와 직접 비교해 봤고 SuperScript® III RT가 경쟁사의 효소에 비해 cDNA 수율을 늘리고, 민감도가 더 높고, full-length 전사물을 더 많이 생성한다는 사실을 발견했습니다(그림 6). 또한, 독립적인 데이터는 SuperScript® III RT가 여러 상용 역전사효소에 비해 더 높은 full-length cDNA 수율을 제공한다는 사실을 잘 보여줍니다.
그림 6. 경쟁사의 역전사효소에 비해 SuperScript III Reverse Transcriptase는 end-point RT-PCR에서 더 많은 full-length cDNA와 대표적인 cDNA를 생성합니다.
세포에서 직접 cDNA 합성 | 첫 가닥 cDNA 합성 | End-point cDNA 합성 |