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Quantification rapide, précise, sensible et spécifique de l’ADN, de l’ARN, des protéines et des endotoxines
La quantification des acides nucléiques et des protéines est importante pour les applications en aval comme le séquençage de nouvelle génération (NGS), la PCR, la transfection, le Western Blot, les immunodosages, etc. Les fluorimètres Qubit 4 et Qubit Flex quantifient ces cibles en détectant les colorants fluorescents dans une variété de dosages Qubit qui se lient spécifiquement à leurs molécules cibles. Les mesures sont exactes, précises et sensibles et le processus est rapide et facile.
Technologie de quantification par fluorescence Qubit
Les fluorimètres Qubit détectent des colorants fluorescents dans les dosages Qubit, qui sont très spécifiques à une molécule d’intérêt cible dans vos échantillons. Ces colorants émettent un signal fluorescent uniquement lorsqu’ils sont liés à leurs cibles, même à de faibles concentrations, ce qui fait que les lectures sont également très sensibles. Les colorants sont absorbés en quelques minutes et peuvent être lus en quelques secondes par des fluorimètres Qubit, qui interpolent les mesures sur une courbe standard.
La technologie de fluorescence Qubit est tellement sensible que les dosages Qubit ne nécessitent que 1 µl d’échantillon, même si l’échantillon est très dilué. Cela en fait une solution idéale pour la quantification d’échantillons précieux.
Précis, spécifique et sensible
Les fluorimètres Qubit 4 et Qubit Flex fournissent des mesures de quantification rapides et précises de la molécule spécifique qu’ils sont conçus pour détecter, même en très petites quantités. Par exemple, Qubit permet aux dosages d’ADN pour détecter des molécules d’ADN simple brin ou double brin (ADNsb ou ADNdb). Ces dosages sont hautement sélectifs pour leur type d’ADN cible, même en présence d’ARN ou de l’autre type d’ADN, ou de contaminants courants tels que les sels, les nucléotides libres, les solvants, les détergents et les protéines.
Quantification de l’ADN
Dans ce test, le dosage Qubit dsDNA HS (haute sensibilité) a présenté une plage de détection linéaire de 0,2–100 ng et une sélectivité pour l’ADN double brin (ADNdb), même en présence d’une masse égale d’ARN.
L’exactitude et la précision ont été évaluées sur les fluorimètres Qubit 4 et Flex, ainsi que sur un instrument concurrent, avec le dosage d’ADNdb HS Qubit et le dosage Qubit dsDNA BR (large plage) , qui est optimisé pour détecter des concentrations plus élevées d’ADNdb. L’exactitude et la précision étaient plus élevées pour les instruments Qubit que pour l’instrument concurrent, et l’instrument Qubit Flex offrait un débit accru.
Dans une publication indépendante de 2013 dans PLoS One, Simbolo et coll. ont indiqué que la quantification fluorimétrique Qubit était une méthode fiable et rentable pour qualifier diverses préparations d’ADN pour le NGS, y compris celles dérivées d’échantillons de tissus congelés et de FFPE. Parmi les instruments qu’ils ont testés, leurs données ont montré que les résultats de quantification de l’ADN obtenus à l’aide du fluorimètre Qubit étaient hautement reproductibles et concordaient avec les données de qPCR pour la quantité d’ADN, même pour l’ADN partiellement dégradé provenant d’échantillons FFPE.¹
1 Simbolo M, Gottardi M, Corbo V et coll. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS ONE. 2013; 8: e62692. Texte complet
Évaluation quantitative de l’ARN
Qubit fournit des dosages ARN afin de détecter à la fois les grandes molécules d’ARN intact (telles que l’ARNr ou les grosses molécules d’ARNm) et les petites molécules d’ARN intact (telles que le microARN et le siRNA). Ces dosages sont hautement sélectifs pour leur type d’ARN, même en présence d’ADN ou de l’autre type d’ARN, ou de contaminants courants. Dans ce test de sensibilité, les mesures réalisées par les dosages d’ARN et de microARN Qubit étaient très proches des concentrations réelles de leurs ARN cibles.
Plus sensibles et sélectifs que l’absorbance UV
Les fluorimètres Qubit sont largement plus sensibles que l’absorbance UV, une méthode alternative qui permet de quantifier les acides nucléiques grâce à leur absorption de la lumière ultraviolette à 260 nm. Historiquement, les spectrophotomètres qui mesurent l’absorbance UV ne pouvaient pas discerner les différences entre l’ADN, l’ARN, les nucléotides libres, les sels excédentaires et d’autres composés organiques, qui absorbent tous à cette longueur d’onde.
Bien que les algorithmes logiciels avancés sur les instruments UV-Vis (ultraviolet/visible) qui analysent plus de spectres parviennent à différencier l’ADN de l’ARN, ils ne peuvent toujours pas distinguer l’ADNdb de l’ADNsb ou l’ARNr du microARN. De plus, la spectrophotométrie UV n’a souvent pas la sensibilité nécessaire pour mesurer avec précision les faibles concentrations d’ADN et d’ARN.
Remarque : Bien que l’absorbance UV ne soit pas aussi sensible ou sélective que la fluorimétrie pour la quantification des acides nucléiques ou des protéines, elle est excellente pour détecter les impuretés dans un échantillon. De nombreux laboratoires utilisent ces deux technologies à des fins différentes. Comparez les deux et découvrez nos spectrophotomètres NanoDrop sur notre page Quantification de l’ARN/ADN.
2. Simbolo M, Gottardi M, Corbo V et coll. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS ONE. 2013; 8: e62692. Texte complet
Simple et rapide
Les fluorimètres Qubit sont simples à utiliser : il vous suffit de suivre les instructions détaillées qui s’affichent à l’écran. Ils sont même dotés d’un calculateur intégré pour déterminer la quantité exacte de colorant et de tampon à utiliser, en fonction du nombre d’échantillons et d’étalons que vous testez. La vidéo ci-dessous illustre ce processus simple et intuitif.
Après avoir isolé vos échantillons d’ADN, d’ARN ou de protéines, mélangez-les avec du colorant et du tampon dans les proportions recommandées et pipetez-les dans les tubes de dosage ou les barrettes de tube. De la même manière, préparez vos deux (ou trois) étalons, que vous pouvez utiliser pour plusieurs échantillons. Une fois le test lancé, il ne faut que quelques secondes pour que l’instrument indique les résultats.
Vous pouvez ensuite exporter les résultats vers un compte Thermo Fisher Connect Cloud via Wi-Fi ou transférer un fichier CSV standard vers un ordinateur via une clé ou un câble USB.
Si vous avez un plus grand nombre d’échantillons à traiter, utilisez le fluorimètre Qubit Flex pour augmenter votre débit. Le graphique montre le temps d’obtention des données, y compris la préparation et la mesure des échantillons, pour un nombre donné d’échantillons avec le fluorimètre Qubit 4 ou Flex ainsi qu’un instrument concurrent.
Conseil : Pour la quantification à haut débit, envisagez l’utilisation d’un lecteur de microplaques à fluorescence.
Les lecteurs de microplaques multimode Varioskan ALF and Varioskan LUX Thermo Scientific sont compatibles avec les dosages Quant-iT pour quantifier les mêmes analytes que les fluorimètres et dosages Qubit. Pour comparer ces systèmes, consultez notre page Quantification de l’ARN/ADN.
Calculateurs intégrés pour la préparation des échantillons et les applications en aval
Tous les fluorimètres Qubit sont dotés d’un Calculateur de réactifs intégré, qui vous aide à déterminer la quantité de réactif et de tampon à utiliser lors de la préparation de votre solution de travail, en fonction du nombre d’échantillons et d’étalons que vous testez. Il peut être utilisé pour déterminer les volumes de Master Mix pour les échantillons et les étalons.
Reagent calculator
Le fluorimètre Qubit Flex comporte trois calculateurs supplémentaires pour rationaliser votre flux de travail. Du côté de la préparation de l’échantillon, pour le dosage que vous avez sélectionné, le calculateur de plage de dosage affiche la plage de concentration de l’échantillon de base pour laquelle il est le plus précis, ainsi que les plages étendues haute et basse, en fonction de votre volume d’échantillon.
Pour faciliter votre transition vers les applications en aval, en particulier le NGS, deux calculateurs vous aident à gérer les données des échantillons de dosage et à effectuer des dilutions et des conversions d’unités courantes. Le Calculateur de molarité vous permet de déterminer la molarité d’un échantillon en fonction de la longueur de l’acide nucléique et de la concentration mesurée. Pour les applications de séquençage, le Calculateur de normalisation remplace la feuille de calcul souvent utilisée pour normaliser les échantillons pendant la préparation de la bibliothèque. Pour chaque cycle, il recommande la quantité d’échantillon et de tampon à ajouter pour atteindre une masse, une concentration ou une molarité souhaitée et normalisée. Vous pouvez exporter facilement les résultats vers un compte Thermo Fisher Connect Cloud via Wi-Fi, ou dans un fichier CSV standard sur un ordinateur ou un autre périphérique via une clé USB ou un câble Ethernet.
Logiciel d’aide à la conformité avec la norme 21 CFR Part 11
La solution logicielle Qubit Flex SAE est un module logiciel en option qui prend en charge la norme FDA 21 CFR Part 11 pour la gestion électronique des dossiers ainsi que les signatures électroniques.
La conformité à la norme FDA 21 CFR Part 11 est composée d’exigences de procédure et techniques.
- Les exigences de procédure correspondent à la procédure d’exploitation standard définie par l’établissement de l’utilisateur final
- Les exigences techniques correspondent aux caractéristiques fonctionnelles du logiciel de gestion de la conformité utilisé
Le respect des exigences techniques ne garantit pas à lui seul la conformité à la norme 21 CFR Part 11. La conformité est la conséquence du processus de travail de l’établissement et des systèmes utilisés.
Les fonctionnalités du logiciel incluent la restriction des utilisateurs non autorisés, les politiques de mot de passe et les dates d’expiration, les autorisations et rôles utilisateur définis, les journaux et rapports d’audit, ainsi que les flux de travail de signature électronique intégrés. Tous les fluorimètres Qubit Flex (v.1.7.0 ou ultérieure du micrologiciel d’exploitation) peuvent fonctionner en mode SAE après l’achat de la licence logicielle Qubit Flex SAE. Pour atteindre la conformité à la norme 21 CFR Part 11, votre établissement doit également définir et documenter des procédures d’exploitation uniformisées.
Composants
La solution logicielle Qubit Flex SAE comprend trois composants qui communiquent entre
- Le logiciel SAE est utilisé pour configurer les paramètres de sécurité, d’audit et de signature électronique (SAE) pour le fluorimètre Qubit Flex. Le logiciel SAE se compose de la console administrateur SAE (installée sur un serveur informatique en réseau avec une adresse IP statique) et du profil d’application SAE.
- La licence SAE est utilisée pour activer les paramètres SAE pour le fluorimètre Qubit Flex.
- Le mode SAE s’exécute sur le fluorimètre Qubit Flex et se connecte à distance à la console administrateur SAE.
Composant 1 : Logiciel SAE : Console administrateur SAE
La console administrateur SAE est le composant de la solution logicielle Qubit Flex SAE pour l’aide à la conformité avec la norme 21 CFR Part 11 qui permet la configuration de l’instrument Qubit Flex pour répondre aux besoins spécifiques de l’utilisateur. Il est modulable et prend en charge d’autres instruments Invitrogen, c’est pourquoi le profil d’application Qubit Flex doit être installé sur la console administrateur SAE avant que les paramètres SAE de l’instrument Qubit Flex puissent être utilisés. Une fois que le profil d’application Qubit Flex est installé sur la console administrateur SAE, un serveur SAE (ordinateur de réseau) est utilisé pour se connecter à l’instrument Qubit Flex. La console administrateur SAE doit fonctionner à partir d’un ordinateur de réseau avec une adresse IP statique.
Composant 2 : Licence SAE
La licence logicielle Qubit Flex SAE pour l’aide à la conformité avec la norme 21 CFR Part 11 est destinée à être utilisée avec le fluorimètre Qubit Flex et prend en charge la conformité avec la norme FDA 21 CFR Part 11 concernant la sécurité, l’audit et les signatures électroniques (SAE) à l’aide de la console administrateur SAE. Une licence logicielle SAE est requise pour activer le mode SAE sur chaque fluorimètre Qubit Flex. Pour activer la licence, le système Qubit Flex doit être mis à jour vers la version logicielle 1.7.0 ou ultérieure.
Composant 3 : Mode SAE
Lorsque le mode SAE est activé, l’instrument Qubit Flex se connecte à la console administrateur SAE via le serveur SAE. Les paramètres de sécurité, d’audit et de signature électronique, tels que définis dans la console administrateur SAE, sont implémentés sur le fluorimètre Qubit Flex.
Les fonctionnalités incluent la restriction des utilisateurs non autorisés au système, les politiques de mot de passe et les dates d’expiration, les autorisations et rôles utilisateur définis, les journaux et rapports d’audit et les flux de travail de signature électronique intégrés. Tous les fluorimètres Qubit Flex (v.1.7.0 ou ultérieure du micrologiciel d’exploitation) peuvent fonctionner en mode SAE grâce à l’achat de la licence logicielle SAE Qubit Flex.
Fonctionnalité
Fonctionnalité de la console administrateur SAE
| Sécurité du système | Contrôle l’accès des utilisateurs au logiciel par le biais d’ID utilisateur, de mots de passe, de rôles et d’autorisations. Deux rôles utilisateur par défaut sont fournis : l’un avec des privilèges complets (Administrator [Administrateur]) et l’autre avec certains privilèges supprimés (Scientist [Scientifique]). Les rôles utilisateur par défaut peuvent être modifiés et des rôles et autorisations d’utilisateur supplémentaires peuvent être créés. |
| Vérification | Suit les actions effectuées par les utilisateurs et les modifications apportées aux paramètres de la console administrateur SAE. Lorsque l’audit est activé, le logiciel contrôle silencieusement les actions qui entraînent des modifications au niveau des données ou de l’instrument. L’option permettant de demander aux utilisateurs de saisir un motif d’audit (motif pour effectuer une action ou une modification) est disponible. La fonction d’audit fournit des rapports pour les modifications et actions auditées de la console administrateur SAE. |
| Signature électronique (e-signature) | Détermine les fonctions pour lesquelles les utilisateurs doivent fournir un nom d’utilisateur et un mot de passe. Vous pouvez configurer l’événement e-signature pour qu’il nécessite plusieurs signatures et demander aux utilisateurs disposant d’autorisations spécifiques de signer. |
Sécurité du système
L’accès est limité au personnel autorisé via le nom d’utilisateur et le mot de passe.
Vérification
La fonction d’audit de la console administrateur SAE permet de suivre les actions effectuées par les utilisateurs ainsi que les modifications apportées aux paramètres SAE. Les actions suivies de manière silencieuse comprennent la connexion, la déconnexion ainsi que la génération et l’exportation de données.
Au sein de la fonction d’audit, il existe des options permettant d’indiquer si des actions utilisateur spécifiques feront l’objet d’un audit silencieux, facultatif ou obligatoire. En outre, des rapports peuvent être générés sur des actions utilisateur, des modifications du module SAE et des actions et événements du logiciel ou de l’instrument.
Signatures électroniques (e-signatures)
La fonction e-signature de la console administrateur SAE détermine les fonctions pour lesquelles les utilisateurs doivent satisfaire aux exigences de signature.
Dans la fonction e-signature, vous pouvez configurer le nombre d’utilisateurs dans différents rôles qui doivent signer chaque événement e-signature. Vous pouvez également créer des significations distinctes et personnaliser les exigences de signature pour chaque.
Informations de commande
Pour utiliser la solution logicielle Qubit Flex SAE avec votre fluorimètre Qubit Flex, vous pouvez acheter une licence logicielle séparément ou dans un ensemble instrument Qubit Flexet licence logicielle.
Si vous disposez déjà d’un fluorimètre Qubit Flex, vérifiez que votre instrument est équipé de la version 1.7.0 ou ultérieure du micrologiciel pour activer cette option.
Les instructions de génération d’une clé de licence sont indiquées dans le manuel d’utilisation SAE.
Large éventail de dosages et d’applications
La quantification des acides nucléiques est importante pour les applications ADN et ARN en aval, telles que le NGS, le séquençage d’ARN, la PCR, la qPCR, le clonage, la préparation plasmidique et la transfection. La quantification des protéines est importante pour les applications telles que l’électrophorèse des protéines, le Western Blot, la spectrométrie de masse et les immunodosages.
Les dosages Invitrogen Qubit utilisent des colorants sélectifs cibles qui émettent un signal fluorescent lorsqu’ils sont liés à l’ADN, à l’ARN ou à la protéine. La mesure de la fluorescence est à la fois plus sensible et plus spécifique que d’autres méthodes telles que les dosages d’absorbance UV ou les dosages Bradford, qui peuvent surestimer les concentrations d’échantillons en raison de la présence de contaminants tels que les sels, les solvants, les détergents, les protéines et les nucléotides libres.
Il existe des dosages Qubit pour un large éventail d’applications de quantification :
Quantification de l’ADN
Les dosages d’ADN Qubit sont hautement spécifiques à l’ADNdb sur deux plages de concentration différentes, ou à l’ADNsb et aux oligonucléotides.
Évaluation quantitative de l’ARN
Les dosages d’ARN de Qubit mesurent de grandes molécules d’ARNr et d’ARNm sur trois plages de concentration différentes, ou de molécules de petit ARN telles que le microARN.
Intégrité et qualité (IQ) de l’ARN
Un dosage de qualification unique qui calcule le rapport de molécules de grand ARN et d’ARN intact et/ou structuré par rapport aux molécules de petit ARN et d’ARN dégradé.
Quantification des protéines
Les dosages protéiques Qubit mesurent rapidement la teneur en protéines sur deux plages de concentration différentes, toutes deux plus larges que les dosages de quantification protéique de Bradford traditionnels.
Dosages de détection des endotoxines
Offre un dosage par fluorescence en point final efficace pour quantifier les endotoxines dans divers types d’échantillons tels que les protéines, les peptides, les anticorps ou les acides nucléiques.
Dosages de vérification du système
Dosages réactifs rapides et faciles à utiliser qui permettent de tester les performances des fluorimètres Qubit 4 et Qubit Flex.
Kit de contrôle qualité Ion Sphere
Spécialement conçu pour évaluer les particules Ion Sphere (ISP) enrichies avant le séquençage sur Ion Personal Genome Machine (PGM) ou sur le système Ion GeneStudio.
Dosages personnalisés MyQubit (Qubit 4 uniquement)
Créez vos propres dosages de quantification pour le fluorimètre Qubit 4.
Mode fluorimètre et dosages personnalisés MyQubit
En mode Fluorimètre, le fluorimètre Qubit peut être utilisé comme minifluorimètre. Plutôt que d’effectuer un étalonnage de dosage et de calculer les résultats en fonction d’un algorithme, l’instrument génère et affiche des valeurs d’unité de fluorescence brute (RFU) pour chaque échantillon.
En mode Fluorimètre, vous pouvez choisir la LED bleue ou rouge comme source d’excitation. Si vous choisissez l’excitation bleue, l’instrument lit les valeurs de fluorescence dans les canaux d’émission verts et rouge lointain. Si vous choisissez le rouge, l’émission est lue uniquement dans le canal rouge lointain.
Mode Fluorimètre
Pour accéder au mode Fluorimètre, appuyez sur Fluorometer (Fluorimètre) sur l’écran d’accueil. Choisissez si vous souhaitez utiliser la source d’excitation bleue (470 nm) ou rouge (635 nm). Une fois que vous avez inséré votre échantillon et sélectionné Read tube (Lire le tube), vos résultats en RFU s’affichent à l’écran.
Dosages MyQubit
Les données recueillies en mode Fluorimètre sur le Qubit 4 peuvent être utilisées pour concevoir votre propre dosage à l’aide de l’outil de conception de dosages MyQubit. Cet outil vous permet de créer des dosages personnalisés pour le fluorimètre Qubit 4 en quelques minutes. Il vous suffit de saisir vos paramètres de dosage dans l’outil en ligne, puis d’enregistrer et de télécharger le fichier .qbt sur votre fluorimètre Qubit à l’aide d’une clé USB.
Des dosages MyQubit préconfigurés sont disponibles pour quantifier le cholestérol, le galactose, le glucose, l’acide glutamique, le peroxyde ou le saccharose. Vous pouvez télécharger ces fichiers .qbt sur votre ordinateur, puis les télécharger sur votre fluorimètre Qubit 4 à l’aide d’une clé USB. Ces dosages sont des exemples des types de dosages MyQubit que vous pouvez créer vous-même.
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.