El kit IP/Co-IP magnético entrecruzado Thermo Scientific Pierce utiliza química de entrecruzamiento para inmovilizar covalentemente anticuerpos IP en gránulos magnéticos de proteína A/G de calidad superior para una inmunoprecipitación y una coinmunoprecipitación eficaces.

Debido a que este procedimiento de IP magnética implica la unión covalente del anticuerpo específico utilizado para la inmunoprecipitación, las proteínas diana o los complejos de proteínas co-IP pueden eluir y analizarse sin fragmentos de anticuerpos, porque el anticuerpo permanece fijado a las partículas. El kit contiene un protocolo optimizado y todos los tampones y reactivos necesarios para lograr IP o co-IP de alta producción con anticuerpos que se unen a la proteína A/G y que utilizan herramientas de separación magnética manuales o automáticas.

Características del kit IP/Co-IP magnético entrecruzado:

• IP libre de anticuerpos: el anticuerpo se une irreversiblemente a los gránulos magnéticos, lo que resulta en una coelución insignificante de anticuerpos intactos o cadenas pesadas y ligeras con el antígeno purificado
• Cómodo: el kit IP/Co-IP contiene gránulos magnéticos y todos los tampones esenciales para una inmunoprecipitación óptima
• Rápido: entrecruzamiento completo e inmunoprecipitación en menos de tres horas
• Eficaz: inmunoprecipitado con la mitad del volumen recomendado de partículas magnéticas en comparación con otros gránulos magnéticos
• Compatible: los gránulos magnéticos, junto con la proteína A/G recombinante, garantizan la compatibilidad con la mayoría de los anticuerpos primarios, ya sean de ratón o de conejo
•Escalable: use solo la cantidad de anticuerpo necesaria para un solo experimento de IP o para preparar una mayor cantidad de gránulos magnéticos de anticuerpo entrecruzado para múltiples experimentos

El protocolo para el kit IP/Co-IP magnético entrecruzado Pierce une el anticuerpo de IP a los gránulos magnéticos de proteína A/G y luego, de forma covalente, entrecruza el anticuerpo con los gránulos usando disuccinimidil suberato (DSS). Los gránulos entrecruzados con anticuerpos se incuban después con lisado celular o extracto de tejido que contenga el antígeno proteico de interés, lo que permite la formación del complejo antígeno:anticuerpo. Los gránulos se lavan para eliminar el material no ligado y se utiliza un tampón de elución de pH bajo para disociar el antígeno ligado de los gránulos entrecruzados a anticuerpos. El tampón de neutralización se incluye para evitar la precipitación del antígeno aislado y para garantizar la actividad de las proteínas en las aplicaciones posteriores. El tampón de muestras de marcadores para carriles se incluye para preparar muestras para el análisis de SDS-PAGE. El protocolo está optimizado para 2 a 10 µg de anticuerpo IP. Para obtener un producción óptima de la co-IP, utilice de 5 a 10 µg de anticuerpo. Los gránulos se eliminan manualmente de la solución mediante un soporte magnético o mediante automatización con un instrumento, como el KingFisher Flex de Thermo Scientific.

El IP tradicional (sin unión covalente de anticuerpos) generalmente proporciona producciones de antígeno más altas que los protocolos de IP que utilizaban el entrecruzamiento. Esto se debe a que el proceso de entrecruzamiento inevitablemente causa la pérdida de algunos puntos de unión de anticuerpos funcionales. Para superar esta limitación con el método de entrecruzamiento, puede que sea necesario utilizar cantidades algo mayores de anticuerpo de IP en el método de IP entrecruzado que en el procedimiento de IP tradicional equivalente. La ventaja que se obtiene con el procedimiento de inmunoprecipitación entrecruzado son los Western blots desprovistos de bandas de anticuerpos interferentes.

Resumen del protocolo
1: Gránulos de prelavado con un tampón de acoplamiento.
2: Una el anticuerpo a los gránulos magnéticos de proteína A/G durante 15 minutos.
3: Lave los gránulos tres veces con un tampón de acoplamiento.
4: Entrecruce el anticuerpo a los gránulos con DSS durante 30 minutos.
5: Lave el gránulo tres veces con un tampón de elución y luego dos veces con un tampón de lisis/lavado de IP.
6: Incube el lisado celular con gránulos preparados durante una o dos horas a temperatura ambiente, o durante la noche, a 4 °C.
7: Lavado de gránulos dos veces con tampón de lisis/lavado IP y luego una vez con agua purificada.
8: Eluya el antígeno ligado.

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