Pierce™ Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit

Das Thermo Scientific Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit bietet Forschern eine rationalisierte, robuste Methode zur Anreicherung von Protein-RNA-Interaktionen unter Verwendung von endmarkierter RNA als Köder.

Merkmale des Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kits:

• Direkt – Erfassung von Ribonucleoprotein-Komplexen direkt mit End-markierter RNA; verwendet keine Antikörper für Pull-Down
• Anwenderfreundlich – Keine Spin-Becher oder Zentrifugation erforderlich für die Anreicherung von RBP; Rationalisiertes Verfahren für minimale praktische Handhabung (weniger als 3 Stunden) nach RNA-Markierungsreaktion
• Flexibel – Einsatz von In-vitro-transkribierter RNA oder synthetischer RNA zur Markierung verschiedener Längen und Komplexität; erfolgreich angereicherte Proteine mit endogenen, überexprimierten und in vitro-translatierten Lysaten
• Spezifisch – Niedriger Hintergrund der Beads; Unabhängige RNA oder mutierte RNA reichert spezifizierte RRP nicht signifikant an
• Kostengünstig – Günstiger als der Erwerb kommerziell synthetisierter, endmarkierter RNA, magnetischer Beads und Reagenzien separat
• Komplett – Enthält sowohl Kennzeichnungs- als auch Anreicherungsmodule mit Puffern, die für den Assay erforderlich sind; positive Kontroll-RNA, negative Kontroll-RNA und RBP-Antikörper im Lieferumfang enthalten

Das Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit enthält Reagenzien zur effizienten Anreicherung von RNA-Bindungsproteinen (RBPs) mit RNA-Endmarkierung mit Desthiobiotin und Streptavidin-Magnetbeads. Das Komplettkit enthält Reagenzien, die für 20 RNA-Markierungsreaktionen und 20 Protein-RNA Pull-Down Assays ausreichen. Diese direkte Anreicherung von Protein-RNA-Wechselwirkungen stellt eine Alternative zum Einfangen der Protein-RNA-Komplexe bzw. Strukturen in Nukleinsäuren mit Antikörpern dar. Das Kit bietet außerdem den Vorteil von validierten Kontrollen für die Markierung und den Pull-Down Assay. Das Kit ist für mehrere nachgeschaltete Anwendungen geeignet, einschließlich Western Blotting und Massenspektrometrie (MS).

Im Lieferumfang enthalten:
Das komplette Kit enthält das Pierce RNA 3'-End Desthiobiotinylierungskit, positive und negative RNA-Kontrollen, Nukleinsäure-kompatible Streptavidin-Magnetbeads und Puffer für die RBP-Anreicherung und -elution

Erfordert:
Vom Anwender bereitgestellte RNA und Lysat (experimentelle Probe)

Anwendungen:
• Mutationsanalyse
• Strukturfunktionsanalyse
• Identifizierung von RNA-Protein-Interaktionen
• MS-Analyse unbekannter RNA-Proteinbindungspaare oder -komplexe

Die Verwendung markierter RNA als Köder für die RNA-bindende Proteinanreicherung ist gegenüber der Antikörperanreicherung vorteilhaft, da sie die Interaktion direkt erfasst. Enthält das Pierce RNA 3'-End Desthiobiotinylation Kit, mit dem einzelne Cytidinbisphosphatnukleotide mit T4 RNA-Ligase an die 3‘-Enden einzelsträngiger RNA angehängt werden. Desthiobiotin kann zum Nachweis oder aufgrund seiner Affinität zur Elution genutzt werden. Die Länge des Spacers zwischen Nukleotid und Desthiobiotin wurde für eine effiziente Befestigung an den Beads optimiert, ohne die Zugänglichkeit der RNA zu Proteinen zu beeinträchtigen.

Das Verfahren zur Anreicherung von RNA-bindenden Proteinen wurde für eine einfache Anwendung optimiert. Die markierte RNA wird zunächst von den Beads eingefangen, um die RNA für die Bindung von Protein auszurichten. Vor der Zugabe von Proteinlysat werden die Beads mit gebundener RNA in Protein-RNA-Bindungspuffer äquilibriert. Die Beads werden gewaschen, und die Probe wird entweder mit nicht-denaturierendem Biotin-Elutionspuffer oder SDS-PAGE-Ladepuffer eluiert. Eluierte Proben eignen sich für eine Vielzahl nachgelagerter Anwendungen, einschließlich Western Blotting oder Massenspektrometrie.

Das Kontrollsystem für den Pull-down-Assay verwendet 3'-nicht translatierte Region-Androgen-Rezeptor-RNA (AR), Poly(A)25 RNA und Säugetierzelllysat. Die proximale nicht translatierte Region (UTR) am 3'-Ende der Androgenrezeptor-RNA enthält UC-reiche Regionen für HuR- und Poly(C)-Bindungsproteine (CP1 und 2). Diese RNA-Bindungsproteine sind für die Regulierung der Stabilität von mRNA (HuR) und des Umsatzes und der Translation von mRNA (CP1 und 2) zuständig. Die negative Kontroll-RNA, poly(A)25 RNA enthält keine HuR- oder poly(C) BP-Bindungsstellen.

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