Pierce™ Monomeric Avidin UltraLink™ Resin

Das Thermo Scientific Pierce Monomere Avidin UltraLink Harz ist ideal für die Affinitätsreinigung biotinylierter Proteine, Peptide und anderer Moleküle geeignet. Die Immobilisierung von Avidin-Monomeren führt zu einem Aufreinigungsharz mit einer viel geringeren Biotin-Bindungsaffinität als natives tetrameres Avidin und ermöglicht daher milde Elutionsbedingungen.

Das immobilisierte monomere Avidin-Protein bindet Biotin mit hoher Spezifität und mäßiger Affinität. Dadurch können Nicht-Biotinmoleküle ausgewaschen und anschließend die gebunden Biotin-markierten Moleküle mit 2 mM Biotin in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) kompetitiv eluiert werden. Diese Technik bietet die schonendsten Elutionsbedingungen für die Reinigung von biotinylierten Proteinen und vermeidet die Kontamination und andere Probleme, die mit herkömmlichen Avidin- und Streptavidin-Methoden verbunden sind. Die monomere Avidin-Säule kann dann mit 0,1 M Glycin regeneriert werden, um die Spalte des verbleibenden gebundenen Biotins zu isolieren, ohne die Fähigkeit zu verlieren, eine andere biotinylierte Probe zu binden.

Mit typischem Avidin oder Streptavidin ist die Biotin-Bindungsaffinität (Kd = 10^-15 M) so groß, dass die Aufreinigung mit diesen herkömmlichen Medien Denaturierungsbedingungen für die Elution erfordert, wie z. B. 8 M Guanidin·HCl bei pH 1,5 oder Sieden beim Reduzieren des SDS-PAGE-Probenladepuffers. Neben den unerwünschten Wirkungen dieser Mittel auf die interessierenden biotinylierten Proteine verursachen solche aggressiven Elutionsbedingungen in der Regel Verunreinigungen, denn unerwünschte Proteine (wie z. B. Avidin- oder Streptavidin-Untereinheiten) können vom Harz abgelöst werden und zusammen mit dem gewünschten Reinigungsprodukt eluiert werden. Wenn Avidin dagegen als Monomer-Untereinheit an ein Harz (z. B. vernetzte Agarose-Beads oder UltraLink Harz) gekoppelt wird, bleibt seine Spezifität für Biotin erhalten, aber seine Biotin-Bindungsaffinität verringert sich auf ein Niveau (Kd = 10^-8 M), das der nachfolgenden Elution förderlich ist.

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