Das RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit für FFPE ist für die Extraktion der Gesamtnukleinsäure aus Formalin- oder Paraformalin-fixiertem und in Paraffin eingebettetem (FFPE) Gewebe bestimmt. Es enthält ausreichend Reagenzien für 40 Aufreinigungen von bis zu vier 20 μm-Abschnitten oder von bis zu 35 mg Kernproben ohne Unterteilung. Merkmale des RecoverAll™ Gesamt-Nukleinsäure-Isolierungskits für FFPE:

• Optimiert für die Isolierung von Gesamt-Nukleinsäuren einschließlich microRNAs aus FFPE-Gewebe
• Keine nächtliche Proteinase-K-Verdauung erforderlich – eine Entparaffinisierung am Morgen und eine qRT-PCR am Nachmittag
• Typische Ausbeuten sind > 50 % der Ausbeute von nicht fixiertem Gewebe
• Rückgewonnene Nukleinsäuren eignen sich für Sequenzierung der nächsten Generation, Echtzeit-RT-PCR, PCR, Mutationsscreening und Microarray-Analysen

Extraktion von Nukleinsäuren aus schwierigen Proben
Archivierte Gewebeproben enthalten wertvolle Informationen über Krankheitszustände, aber bisher war es schwierig, aus ihnen Nukleinsäuren von einer für die molekulare Analyse geeigneten Qualität zu isolieren. Standardmäßige Konservierungstechniken verwenden Formalin zur Erhaltung der Gewebestruktur und Verhinderung von Verwesung. Gleichzeitig werden jedoch auch Nukleinsäuren abgefangen und über Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Vernetzungen modifiziert. RNA (und in gewissem Maße auch DNA) ist oft so fragmentiert und chemisch modifiziert, dass sie mit vielen molekularen Analysetechniken inkompatibel ist. Die RNA-Fragmentierung in FFPE-Geweben kann nicht umgekehrt werden. Die Protease-Verdauungsbedingungen des RecoverAll™ Kits sind jedoch so ausgelegt, dass eine maximale Menge (siehe Abbildung) von eingeschlossenen RNA-Fragmenten aller Größen, einschließlich microRNA, in relativ kurzer Zeit freigegeben wird.

Die Lösung: das RecoverAll™ Gesamt-Nukleinsäuren-Isolierungskit
Das Verfahren für das RecoverAll™ Gesamt-Nukleinsäuren-Isolierungskit benötigt ca. 45 Minuten praktische Zeit und kann in der Regel für RNA in weniger als einem Tag abgeschlossen werden. FFPE-Proben werden mit einer Reihe von Xylol- und Ethanolwäschen entparaffiniert. Anschließend werden sie einem umfassenden Protease-Verdau unterzogen und mit einer für die RNA- oder DNA-Rückgewinnung optimierten Inkubationszeit. Nukleinsäuren werden dann mit einem Schnellglasfilterverfahren gereinigt und entweder in Wasser oder in salzarmem Puffer eluiert.

Nukleinsäuren für nahezu jede nachfolgende Anwendung
Wie bei allen FFPE-Geweben führen Fixierung und Lagerung von Proben typischerweise zu einer Fragmentierung und Modifikation von Nukleinsäuren. Deshalb sind bei Downstream-Anwendungen wie der Microarray-Analyse, die hochwertigere RNA als qRT-PCR benötigen, für optimale Ergebnisse oft Modifikationen erforderlich. Obwohl DNA in der Regel nicht so leicht fragmentiert wie RNA, scheint sie stärker auf Formalin zu reagieren und benötigt einen längeren Protease-Verdau (2 Tage), um wesentliche Mengen DNA freizusetzen.