Bei Thermo Scientific pTZ19R/U handelt es sich um kleine Phagemide mit einer Länge von 2.862 bp, die durch das Einfügen der DNA des Phage f1 intergenen Bereichs (IG) in pUC19 und der T7-Promotor-Sequenz in der Nähe des MCS von pUC19 aufgebaut werden. Die Phagemiden unterscheiden sich in der Ausrichtung der geklonten f1 IG-Region. Sie sind für DNA-Klonierung, Dideoxy-DNA-Sequenzierung, In-vitro-Mutagenese und In-vitro-Transkription in einem System konzipiert. Ein Wirtsstamm, der diese Phagemide enthält, erzeugt einsträngige DNA, wenn er mit dem Helferphage M13K07 überinfiziert ist.

Vorteile

• Isoliert aus E. coli (dam+, dcm+)
• Über 90 % in der superhelikalen Form
• Isoliert aus E. coli (dam+, dcm-)
• Nutzen Sie unser kostenloses Online-Tool REviewer für weitere Informationen zur DNA-Sequenz, Sequenzanalyse und Kartierung.

Anwendungen

• Klonierung
• Sequenzierung von Insert-DNA, In-vitro-Transkription

pTZ19R Inhalt und Anwendungshinweise – pTZ19R/U Phagemide enthalten:
• Das pMB1 Replikon rep, das verantwortlich für die Replikation von Phagemid ist (Quelle – Plasmid pUC19)
• Das bla-Gen, das für Beta-Laktamase kodiert, die Resistenz gegen Ampicillin verleiht (Quelle – Plasmid pUC19)
• Die Region des E. coli Operon lac, die eine CAP-Proteinbindungsstelle, einen Promoter P_lac, eine lac Repressor-Bindungsstelle und den 5’-terminalen Teil des lacZ-Gens enthält, das das N-terminale Fragment der Beta-Galaktosidase (Quelle – pUC19) kodiert. Dieses Fragment ermöglicht das Blau-Weiß-Screening rekombinanter Phagemide in der gleichen Weise wie im pUC18/19 Abschnitt beschrieben
• Ein T7-Promoter, der in der Nähe des MCS von pUC19 eingesetzt wird und die In-vitro-Synthese großer Mengen spezifischer RNA ermöglicht
• Die Phage f1 intergene Region, die die in Cis für die Initiierung und Beendigung der Phage f1 DNA-Synthese (Plus- und Minus-Stränge) und für die Verpackung von DNA in Bakteriophage-Partikel erforderlichen Sequenzen trägt

Die Synthese von einzelsträngiger (Plus-)DNA erfordert das Phage-kodierte Gen II, X- und V-Proteine. Es wird bei ori (+) eingeleitet und verläuft in der angegebenen Richtung. Die Umwandlung von Plus-DNA-Strängen in doppelsträngige DNA erfordert keine der Phagengene. Die DNA-Synthese wird durch einen 30-Nukleotid-RNA-Primer initiiert, der von der Wirt’-RNA-Polymerase synthetisiert wird und bei ori (-) beginnt.

Die Karte zeigt Enzyme, die pTZ19R DNA einmal schneiden. Die von Thermo Scientific hergestellten Enzyme sind orange dargestellt. Die Koordinaten beziehen sich auf die Position des ersten Nukleotids in jeder Erkennungssequenz.

Die genauen Positionen der genetischen Elemente sind auf der Karte dargestellt (Terminierungscodons enthalten). Der Code für bla-Gennukleotide 2732–2664 (komplementärer Strang) für ein Signalpeptid. Das LacZ-Polypeptid, das der wt Beta-Galactosidase entspricht und für das Blau-Weiß-Screening unerlässlich ist, endet an der nt-Position 458 (komplementärer Strang). Die restlichen Aminosäuren im lacZ-Leserahmen werden durch f1 DNA kodiert. Die angegebene rep-Region reicht aus, um die Replikation zu fördern. Die DNA-Replikation beginnt an der Position 1.112 im komplementären DNA-Strang (± 1) und verläuft in der angegebenen Richtung. Phagemide und Plasmide mit pMB1- und ColE1-Replikons sind inkompatibel miteinander, aber vollständig kompatibel mit solchen, die das p15A-Replikon tragen (pACYC177, pACYC184). Von pMB1 stammende Plasmide können mit Chloramphenicol verstärkt werden.