LightShift™ Chemiluminescent EMSA Kit

Le kit EMSA chimiluminescent Thermo Scientific LightShift est un système exceptionnellement robuste et sensible. Il permet de réaliser des analyses de mobilité électrophorétique (EMSA) pour identifier et caractériser les interactions de liaison des protéines à l’ADN. Le kit comprend des réactifs pour paramétrer et personnaliser les réactions de liaison à l’ADN, un ensemble de contrôles de l’extrait d’ADN et de protéines pour tester le système du kit, le conjugué streptavidine-HRP stabilisé pour vérifier la cible biotinylée d’ADN et un module de substrat chimiluminescent extrêmement sensible à des fins de détection.

Caractéristiques du kit EMSA chimiluminescent LightShift :

• Excellent pour détecter les protéines de faible abondance dans les extraits nucléaires
• Sensibilité qui dépasse les méthodes radioactives et digoxigénine
• Compatible avec les conditions de liaison établies précédemment pour les interactions ADN-protéines populaires
• Comprend un système de contrôle EBNA pour aider les nouveaux utilisateurs à développer un dosage de travail et à comprendre les méthodes utilisées pour confirmer la spécificité de l’interaction de liaison

Le principe pour la détection EMSA LightShift est similaire à un transfert Western. L’ADN en duplex marqué aux extrémités par la biotine est incubé avec un extrait nucléaire ou un facteur purifié et soumis à l’électrophorèse sur un gel natif. L’ADN est ensuite transféré rapidement (30 minutes) vers une membrane de nylon positive, réticulé aux UV, analysé avec le conjugué streptavidine-HRP et incubé avec le substrat. Le protocole, du marquage aux résultats, peut être réalisé en une seule journée.

L’interaction des protéines avec l’ADN est essentielle au contrôle de nombreux processus cellulaires, notamment la réplication de l’ADN, la recombinaison et la réparation, la transcription et l’assemblage viral. Une technique centrale pour étudier la régulation des gènes et déterminer les interactions protéine-ADN est le retard sur gel (EMSA).

La technique EMSA repose sur l’observation que les complexes protéine-ADN migrent plus lentement que les molécules d’ADN libres lorsqu’ils sont soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose ou polyacrylamide non dénaturant. Étant donné que le débit de migration d’ADN est décalé ou retardé lors de la liaison protéinique, on dit aussi que l’analyse est un retard sur gel ou un dosage de retard sur gel. Avant l’EMSA, les interactions protéine-ADN étaient étudiées principalement par des dosages de liaison filtration par nitrate de cellulose.

Pour effectuer un tel dosage, il suffit de se procurer une cible d’ADN purifié et marqué aux extrémités par la biotine, un extrait de protéine à tester, une membrane en nylon et des équipements d’électrophorèse de base. Les cibles d’ADN peuvent être synthétisées avec des marqueurs de biotine 5’ ou 3’, ou encore marquées après la synthèse à l’aide du kit Thermo Scientific de marquage d’ADN à la biotine sur l’extrémité 3’ (N° de catalogue 89818). Plusieurs méthodes permettent d’obtenir des extraits protéiques de cellules nucléaires, cytosoliques ou entières. Parmi ces méthodes, nous pouvons citer le kit de réactif d’extraction nucléaire et cytoplasmique Thermo Scientific NE-PER (produit n°78833).

Plus de données sur le produit
• Transfert de gels d’EMSA en utilisant l’appareil de transfert rapide Pierce G2

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