Les caractéristiques de ces indicateurs sont les suivantes :
• Substrat de caspase-3/7 optimisé pour l’analyse de l’apoptose
• Facile à utiliser, ajouter et lire ; aucune lyse cellulaire requise
• Utilisation pour les mesures de périodes de temps ; sélectionnez facilement le point d’intérêt temporel
• Compatible avec les méthodes d’imagerie par fluorescence de cellules vivantes et de fixation à base de formaldéhyde
• Multiplexé : se combine avec d’autres réactifs fluorescents pour confirmer l’apoptose dans la même cellule ou population cellulaire

Réactif de détection vert CellEvent™ Caspase-3/7 : Capacité maximale d’absorption/d’émission de ∼502/530 nm. Détectable avec l’ensemble de filtres FITC/GFP standard.

Réactif de détection rouge CellEvent™ Caspase-3/7 : Capacité maximale d’absorption/d’émission de ∼590/610 nm. Détectable avec l’ensemble de filtres Texas Red standard.

Le réactif de détection rouge CellEvent™ Caspase-3/7 et le réactif de détection vert CellEvent™ Caspase-3/7 sont fournis sous forme de poudre sèche. Il suffit d’ajouter 100 μl de PBS à la poudre pour obtenir une solution mère diluée 100x. Diluez cette solution mère à 1:100 dans un milieu complet, colorez les cellules pendant 30 à 60 minutes et procédez à l’analyse au microscope à fluorescence.

Le réactif de détection rouge CellEvent™ Caspase-3/7 est également fourni sous forme de solution de DMSO déjà préparée. La solution de DMSO est une solution mère diluée 400x prête à l’emploi. Diluez simplement dans un milieu de culture à 1:400 et colorez les cellules pendant 30 à 60 minutes.

Pour empêcher l’élimination des cellules apoptotiques, aucun lavage n’est nécessaire à l’issue de la coloration. Les cellules colorées peuvent être analysées vivantes ou fixées à l’aide d’une solution de paraformaldéhyde 4 %, comme la solution de paraformaldéhyde 4 % Image-IT™, dans un tampon au phosphate de 0,1 M avec pH 7,4, réf. I28800. Une fois fixées, ces cellules peuvent ensuite être traitées pour les flux de travail ICC.

Spécifications du substrat
Les réactifs de détection CellEvent Caspase-3/7 sont constitués dʼun peptide formé de quatre amino-acides (DEVD) conjugué à un colorant de liaison des acides nucléiques. La séquence peptidique DEVD est un site de clivage pour la caspase 3/7, et le colorant conjugué est non fluorescent jusqu’à ce qu’il soit clivé du peptide et lié à l’ADN.

Principes d’action
Le réactif de détection vert CellEvent Caspase 3/7 est intrinsèquement non fluorescent car le peptide DEVD inhibe la capacité du colorant à se lier à l’ADN. Cependant, après l’activation de la caspase-3/7 dans les cellules apoptotiques, le peptide DEVD est clivé, ce qui permet au colorant de se lier à l’ADN et de produire une réponse fluorogène brillante.

Protocole simple en trois étapes
Pour utiliser le réactif de détection CellEvent Caspase 3/7, il suffit de l’ajouter aux cellules et de laisser incuber pendant 30 à 60 minutes avant de visualiser. Les cellules apoptotiques avec la caspase-3/7 activée auront des noyaux vert ou rouge brillant, tandis que les cellules sans caspase-3/7 activée auront un signal fluorescent faible.

La polyvalence du dosage permet la détection et la fixation des cellules vivantes
Ce dosage robuste permet l’étude de l’activation de la caspase-3/7 dans les cellules vivantes. Qui plus est, dans la mesure où les étapes de lavage ne sont pas obligatoires à des fins de détection, les cellules apoptotiques fragiles sont préservées alors qu’elles sont généralement perdues pendant le lavage. Il est important de noter que le signal fluorescent issu du réactif de détection CellEvent Caspase 3/7 peut survivre à la fixation et à la perméabilisation. Ainsi, vous bénéficiez d’une grande flexibilité pour les dosages en point final et la recherche d’autres protéines d’intérêt à l’aide de l’immunocytochimie.