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【やってみた】サイクルシーケンス反応後、精製せずに泳動してみた

Written by | Published: 07.21.2023

シーケンス反応には、蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ダイターミネーター）を用いることで、伸長産物に蛍光が標識されます。シーケンス反応後の反応液中には、使われなかったダイターミネーターが存在します。残存のダイターミネーターが伸長産物とともにキャピラリーに取り込まれると、大きなピーク（Dye Blobピーク）として検出され、その部分のベースコールの精度を低下させます。このため、シーケンス反応後は、未反応のダイターミネーターを取り除く精製が必要となります。
一方で、「サンプル数が多い場合、精製工程は手間と感じる」、「目的領域とDye Blobピークが重ならなければ、精製は不要ですか？」とのお声をいただいたことがありました。そこで、シーケンス反応後、精製せずにそのままジェネティックアナライザでランすると、どのような結果になるか、検証してみました。

実験

使用試薬

使用機器

実験

表1、2の条件でシーケンス反応後、伸長産物を精製せずに電気泳動を行いました。電気泳動は、SeqStudio Genetic Analyzerを使用し、MediumSeqの条件で実施しました。

表1 反応液組成
組成 量/反応
 BigDye™ Terminator v3.1 Ready Reaction Mix 4 µL
 x5 Sequencing Buffer 2 µL
 pGEM -3Zf(+) DNA Control Template（200 ng/µL） 1 µL
 -21 M13 Control Primer（0.8 pmol/µL） 4 µL
 脱イオン水 9 µL
 全量 20 µL
表2　サイクルシーケンスプログラム
ステップ
ホールド 25 サイクル ホールド
温度 96℃ 96℃ 50℃ 60℃ 4℃
時間 60秒 10秒 5秒 75秒 ∞

結果

得られたRawデータを図1に示します。シーケンス産物のピークよりも大きなシグナル強度で、4つのピークがみられ（図1(a) 矢印）、ピーク位置は、～65、65～90、90～120、280～310 baseでした。これら4つのピークより低いシグナル強度の、ブロードなピークも複数観察されました（図1(b) 点線枠内）。これらはいずれも、未反応のダイターミネーターに由来すると考えられます。

未精製シーケンス産物のRawデータ

図1 未精製シーケンス産物のRawデータ
(a) 縦軸最大値　32000 RFU、(b) 縦軸最大値　1200 RFU

Quality Value（QV）は、塩基当たりのベースコール精度の指標となる値で、図2では、エレクトロフェログラムの上にQVバーとして表示されています。QVバーが高いほどQVの値が高いことを示しており、図2では、バーが青色の塩基は、良好な精度でベースコールできていることを示します。シーケンス反応後、精製せずに泳動を行うと、前述の大きなピークの所に加え、複数のブロードピークの箇所で、広範囲にわたりベースコールの精度が悪化しました（図2 (a)）。比較データとして、表1、2の条件でシーケンス反応後、Applied Biosystems™ BigDye XTerminator™ Purification Kitにより精製した場合のデータを図2 (b)に示します。エレクトロフェログラムの上には青色のQVバーが連続しており、良好な精度でベースコールされたことが確認できました。

シーケンス産物のエレクトロフェログラム（0-390 bp）

図2　シーケンス産物のエレクトロフェログラム（0-390 bp）
(a) 未精製、(b) BigDye XTerminator精製

まとめ

今回は、SeqStudio Genetic Analyzerにて、シーケンス反応産物を精製せずに泳動し、シーケンス結果への影響を検証しました。得られたエレクトロフェログラムには、4つの大きなピークとともに、これらよりも低いシグナル強度のブロードなピークが複数みられ、広範囲にわたりベースコールの精度が悪化することが分かりました。今回の結果から、シーケンス反応後の精製工程を省略すると、目的領域の解析結果へ影響する恐れがあると考えられます。より良いシーケンス解析結果を得るためにも、シーケンス反応後は精製を行っていただくことをお勧めします。

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