近年、細胞生物学分野のさまざまな研究は、数々の病態に対する新しい治療法の検索に重要な技術としてさらなる注目を集めています。弊社の細胞イメージアナライザーは、細胞撮影画像から各種情報を数値化することにより、定量的で客観的な細胞解析（HCA/HCS）を可能とする測定機器です。今回は、前回に引き続き、AKTシグナルパスウェイの解析事例をご紹介いたします。

前回は、細胞イメージアナライザーを用いた細胞内分子の検出方法、およびリン酸化AKTの用量反応曲線の結果を示しました。今回は引き続き、GSK3およびFOXO1Aの解析事例をご紹介します。

リン酸化GSK3の用量反応曲線

図1 はIGF-1処理によるGSK3リン酸化反応を蛍光画像として捉えたものです。細胞イメージアナライザーにより、細胞の蛍光画像から、細胞一つ一つの核領域、細胞質領域にある蛍光抗体の発する蛍光強度を測定し、核内／細胞質内の蛍光強度比からリン酸化GSK3の存在量比を測定し、用量反応曲線を作成、半数影響量を算出することができました。

図1 GSKリン酸化反応の蛍光画像と用量反応曲線。 A) 3T3 L1細胞の蛍光画像。培養条件などは図2と同様に、100ng/mlのIGF-1で30分処理された細胞を用い、核およびリン酸化GSKが蛍光染色されました。B) さまざまな濃度のIGF-1によって処理された3T3 L1細胞のリン酸化GSK用量反応曲線。実験は３枚のプレート使って行われました。グラフ横軸はIGF-1処理濃度、縦軸はリン酸化GSKの核内／細胞質内の存在量比を数値化したものです。グラフ下にEC50の値を示しています。

FOXO1Aの核内局在変化

図2 はFOX01Aの核内へのトランスロケーションを蛍光画像から数値化したものです。細胞の蛍光画像にある細胞一つ一つの核領域を定義し、核内にあるFOX01A蛍光のみを測定することで、核内に局在するFOX01Aの用量反応曲線を作成、半数影響量を画像イメージから算出することができました。

図2 FOX01Aの蛍光画像と核内局在変化。 A)血清枯渇培地中で終夜培養された3T3 L1細胞を固定化し、核染色およびFOX01A蛍光染色した蛍光画像です。 B) さまざまな濃度のLY294002によって60分処理された3T3 L1細胞のFOX01A用量反応曲線。実験は3枚のプレート使って行われました。グラフ横軸はLY294002処理濃度、縦軸はFOX01Aの核内蛍光強度（面積平均）を数値化したものです。グラフ下にEC50の値を示しています。

2回に渡ってお送りした細胞イメージアナライザーの解析事例、いかがでしたでしょうか？

細胞イメージアナライザーを用いた解析は、複数の異なる蛋白質が関与する細胞内パスウェイの変化を、画像イメージを取得するという同様の方法を用いて測定数値化し、さらに画像から半数影響量を算出することを可能とします。また、複数の蛋白質の活性化状態、細胞内での局在化を同時にモニターすることも可能とします。

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