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フローサイトメトリーでエキソソームは検出できる！

作成者 11.26.2021

エキソソームは、小さな30～150 nm程度の細胞外小胞（Extracellular vesicles: EV）です。エキソソームは、現在細胞間コミュニケーションを担うために特別に分泌される小胞と考えられ、その機能の理解や応用の開発に向けて、急速に関心が高まってきています。エキソソーム以外にもEVは存在しており、胞間シグナルやタンパク、脂質、核酸の転送に関与しています。また、病気のマーカーとしても知られています。

これらEVは、サイズが小さく、不均一で屈折率が低いため、単一粒子ごとの検出がとても困難であるとされていました。しかし、微小粒子を測定するフィルターを使用することによって、フローサイトメトリーによる単一粒子の検出が可能となり、EVの特性や表現型を検出できるようになりました。

そこで今回は、Invitrogen™ Attune™ NxT Flow Cytometerを用いたエキソソームを始めとする、細胞外小胞（EV）検出のワークフローついて、ご紹介いたします。Attune NxT Flow Cytometerは、超音波によるアコースティックフォーカシングにより、細胞をラインに整列させることで、目詰まりを最小限に抑え、高速で処理することが可能です。

アコースティックフィーカシングの例（サンプル：非溶血未洗浄の希釈全血サンプル）

▼こんな方におすすめです！
・エキソソーム研究にご興味をお持ちの方
・がん研究者の方
・製薬企業の方
・共通機器室でフローサイトメーターを管理されている方

用意するもの

・Attune NxT Flow Cytometer
・Attune NxT Small Particle Side-Scatter Filter （製品番号 100083194）
・ポアサイズ 0.1 µm以下のフィルターユニット
・サイズキャリブレーション用ビーズ
・EV特性解析用抗体および試薬
※試薬はこちらにてご案内しています。

方法

1. サンプル調製時におけるコンタミネーションの予防

測定、サンプル処理に用いる全ての液体をポアサイズ0.1 μm以下のフィルターでろ過します。使用する溶液から微粒物質を取り除くことで、サンプル以外の因子から持ち込まれるノイズを除去します。

フィルターの例Thermo Scientific™ Nalgene™ Rapid-Flow™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units　（製品番号 565-0010）

2. サンプルの調製時

培養上清を120,000 xgで4時間遠心します。上清のみを回収することでサンプルから細胞デブリを除き、小胞が含まれる特定のサイズの画分を分離します。

3. EVの標識

測定、フローサイトメトリー用抗体、または脂溶性色素でEVを標識します。
全ての抗体と試薬は、自家蛍光が出ないようにタイトレーションしてから希釈します。
※抗体、試薬の標識作業後に洗浄は行いません。

4. 機器の調整

微小粒子測定用Invitrogen™ Attune™ NxT Small Particle Side-Scatter Filterとサイズキャリブレーションビーズを用いて、微小粒子の集団を検出できるように検出器の感度設定を行います。また、Thresholdを調整しノイズを低減させます。

ポリエステル ApogeeMix™ シリカビーズ(粒子サイズ：80 nm)を、Attune NxT Small Particle Side-Scatter Filterを用いて測定

5. 測定

サンプルは希釈することによって、単一粒子ごとに一列に整列させることが可能です。
Attune™ NxT Flow Cytometerのフローレートを12.5もしくは25 μL/minに設定します。
サンプルは100 μL以上で測定します。
測定イベントレートを8,000 events/sec以下になるようにサンプル濃度やフローレートを調整しデータを取得します。

測定結果の解析

エキソソームを FM 1-43 脂質親和性スチリル色素で染色し、Attune NxT　Flow Cytometer で解析したデータ

FM1-43陽性の集団をゲートすることでエキソソーム集団のみのデータ解析が可能になります。

まとめ

・実験に使用する全ての溶液を0.1 μm以下のフィルターで処理することにより、試薬由来のバックグラウンドを防ぐことができます。
・Attune NxT Flow CytometerにAttune NxT Small Particle Side-Scatter Filterを使用することで、エキソソームを含む100 nm以下の微小な集団を検出することが可能になります。
・今回のアプリケーションを含む、フローサイトメトリーを用いたEVの検出に関する試薬をこちらのPDFにてご紹介しています。EVの検出をご検討の方はぜひご覧ください。

Attune実績 / ユーザーボイス

・自己免疫疾患に関連するC型レクチン受容体の機能理解を目指して（東北医科薬科大学医学部免疫学 中村晃 氏/海部知則 氏）

・間葉系細胞による免疫細胞の「末梢教育」に着目し、アレルギーや慢性疾患の機序解明へ（千葉大学イノベーション医学領域 倉島洋介 氏）

・疾患特異的マクロファージの機能的多様性（大阪大学微生物病研究所 佐藤荘 氏）

【無料ダウンロード】Attune Acoustic Focusing Cytometer アプリケーションノート集

素早く、簡単、詰まりづらい！ 解析に特化したフローサイトメーターAttune NxT Flow Cytometerを使用した実例と実験手法をまとめたアプリケーションノート集です。

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ApogeeMix is a trademark of Apogee Flow Systems.
研究用にのみ使用できます。診断用には使用いただけません

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