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シーケンス反応試薬の違いによる、高GC含有、ホモポリマー領域の解析結果比較

Written by | Published: 01.23.2024

Applied BiosystemsTMジェネティックアナライザ、およびそれに付随する試薬類は、長い間、高い信頼性と広い汎用性を持つ、サンガーシーケンスのツールとして認められてきました。ことに、当社の製品群の中でも、Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitは25年以上に渡り、信頼されるリーダーの地位を確立しています。
このキットは、難しいテンプレートを含む、さまざまなアプリケーションの要求に対応できるように設計されています。本ブログでは、高GC含有領域やホモポリマー領域など、シーケンスの難易度が高いテンプレートにおいて、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitと類似製品の性能を比較した結果をご紹介します。

高GC含有領域のシーケンス

高GC含有DNAテンプレートのシーケンス解析は、現在も重要な課題として挙げられます。
BigDye Terminator v3.1キットと、類似製品（ここではA社製品とします）の性能を評価するため、テストを実施したところ、図1のAおよびBに示すように、BigDye Terminator v3.1キットは、Forward、Reverseともに高いシグナル強度が検出されました。

高GC含有領域において、各種Cycle Sequencing Kit を0.5 µL使用し反応、Forward/Reverse両側からシーケンスしたRawデータ

図1. 高GC含有領域において、各種Cycle Sequencing Kit を0.5 µL使用し反応、Forward/Reverse両側からシーケンスしたRawデータ
A,B: BigDye Terminator v3.1キットは、5’から3’への高いシグナル強度を示している。
C,D: A社製品を使用した場合、3’末端に向かってシグナル強度が急激に低下する。

一方、A社製品は図1のCおよびDに示すように、シグナル強度が急激に低下しました。
全体的にBigDye Terminator v3.1キットは、高GC含量テンプレートをシーケンスした場合、A社製品を使用した場合よりも、シグナル強度が高く、連続リード長（CRL）も長く得られた結果となりました。

ホモポリマー領域のシーケンス

ホモポリマー領域は、同じ塩基が繰り返し伸長することが特徴で、正確な塩基配列の決定が特に困難な領域です。ポリメラーゼ反応に使用される酵素は、ポリメラーゼのスリップを引き起こし、N-1エラーとして知られるシーケンスエラーを引き起こす可能性があるからです。このようなホモポリマー領域のシーケンスにおいて、両キットの性能を評価するために、チミン（T）の連続配列をテンプレートとして使用しました。

図2で示されているように、BigDye Terminator v3.1キットでは、A社製品と比較してポリメラーゼのスリップが少ないという結果となりました。この特性から、BigDye Terminator v3.1キットはホモポリマー領域をより効率的にシーケンスすることができ、二次解析ソフトウエアでの解析でも、より高いクオリティのデータを得ることができました。一方で、A社製品はホモポリマーリピートの後に塩基判定が途切れ、データのクオリティが低いため解析不可という結果でした。

チミン(T)のホモポリマーリピート領域にいてCycle Sequencing Kit を0.5 µL使用し反応、Forward/Reverse両側からシーケンスした波形データ

図2. チミン(T)のホモポリマーリピート領域にいてCycle Sequencing Kit を0.5 µL使用し反応、Forward/Reverse両側からシーケンスした波形データ
上段：BigDye Terminator v3.1では、より高性能なポリメラーゼを使用しているため、ホモポリマーリピート塩基判定が可能であった。
下段：A社製品では、ポリメラーゼのスリップにより、ホモポリマーリピート後の塩基判定が途切れた。

まとめ

以上の結果より、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitは、難易度の高いテンプレートのシーケンスにおいて、類似製品よりも優れていることが明らかになりました。高GC含有領域を含む幅広い種類のテンプレートにおいて、BigDye Terminator使用時は一貫してより長い連続リード長（CRL）、および高いシグナル強度を得ることができました。さらに、ホモポリマー伸長処理精度の向上により、信頼性の高いデータが得られています。これによりBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitは、幅広いサンプルタイプで正確な結果が得られる、信頼性の高いツールと言えます。

BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitは、サンガーシーケンスにおいて信頼の高い選択肢であり続けています。高GC含有やホモポリマー領域など、困難なシーケンスの場面において優れた性能を発揮しており、信頼性の高い高精度の結果を求める研究者の方々に使用されています。BigDye Terminator v3.1キットは、25年以上にわたる実績と15,000件を超える論文発表により、遺伝子解析分野において信頼性の高いツールとしての地位を確立しているのです。

BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

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