流式细胞分析补偿微球

消除关于补偿的一些猜测

采用多通道、低表达标记或有限样品进行流式细胞分析时,推荐使用补偿微球。 Invitrogen OneComp eBeads补偿微球及 Invitrogen AbC总抗体补偿微球试剂盒可为您提供所需的流式细胞分析补偿。 

补偿微球选择指南
  UltraComp eBeads OneComp eBeads
交叉反应性 仓鼠、小鼠和大鼠来源抗体以及识别κ和λ链
产品形式 单管形式,每次使用一滴
激光兼容性 可兼容大部分标准激光,从紫外光至 633nm 激光 不兼容紫色激光
规格 25 个反应 100 个反应 25 个反应 100 个反应
货 号 01-2222-41 01-2222-42 01-1111-41 01-1111-42
  AbC 总抗体补偿微球试剂盒 抗小鼠补偿微球试剂盒 AbC 抗大鼠/仓鼠补偿微球试剂盒
反应性 仓鼠、小鼠、兔及大鼠抗体* 小鼠单克隆抗体* 兔及仓鼠单克隆抗体*
产品规格 1 管阳性微球;
1 管阴性微球
1 管阳性微球;
1 管阴性微球
1 管阳性微球;
1 管阴性微球
激光兼容性 可兼容大部分标准激光,从紫外光至633nm激光
规格 25 个反应 100 个反应 100 个反应 100 个反应
货 号 A10513 A10497 A10344 A10389
*AbC捕获磁珠可结合全部亚型。
  ArC 胺反应补偿微球试剂盒
反应性 LIVE/DEAD 可固定死细胞染色剂及类似胺反应染料
产品规格 1 管阳性微球; 1 管阴性微球
激光兼容性 可兼容大部分标准激光,从紫外光至633nm激光
规格 25 个反应 100 个反应
货 号 A10628 A10346
  GFP BrightComp eBeads 补偿微球
补偿染料 微球通过一种与 GFP 光谱近似匹配的染料进行染色
产品规格 单管形式,每次使用一滴。 每滴微珠里含有阴性微球和阳性微球。 标记的微球存在 3 种水平的类 GFP 强度。
微球大小 约 5 微米
激光兼容性 可用于 488 nm (蓝色)激光
规格 25 个反应
货 号 A10514
  UltraComp eBeads OneComp eBeads
交叉反应性 仓鼠、小鼠和大鼠来源抗体以及识别κ和λ链
产品形式 单管形式,每次使用一滴
激光兼容性 可兼容大部分标准激光,从紫外光至 633nm 激光 不兼容紫色激光
规格 25 个反应 100 个反应 25 个反应 100 个反应
货 号 01-2222-41 01-2222-42 01-1111-41 01-1111-42
  AbC 总抗体补偿微球试剂盒 抗小鼠补偿微球试剂盒 AbC 抗大鼠/仓鼠补偿微球试剂盒
反应性 仓鼠、小鼠、兔及大鼠抗体* 小鼠单克隆抗体* 兔及仓鼠单克隆抗体*
产品规格 1 管阳性微球;
1 管阴性微球
1 管阳性微球;
1 管阴性微球
1 管阳性微球;
1 管阴性微球
激光兼容性 可兼容大部分标准激光,从紫外光至633nm激光
规格 25 个反应 100 个反应 100 个反应 100 个反应
货 号 A10513 A10497 A10344 A10389
*AbC捕获磁珠可结合全部亚型。
  ArC 胺反应补偿微球试剂盒
反应性 LIVE/DEAD 可固定死细胞染色剂及类似胺反应染料
产品规格 1 管阳性微球; 1 管阴性微球
激光兼容性 可兼容大部分标准激光,从紫外光至633nm激光
规格 25 个反应 100 个反应
货 号 A10628 A10346
  GFP BrightComp eBeads 补偿微球
补偿染料 微球通过一种与 GFP 光谱近似匹配的染料进行染色
产品规格 单管形式,每次使用一滴。 每滴微珠里含有阴性微球和阳性微球。 标记的微球存在 3 种水平的类 GFP 强度。
微球大小 约 5 微米
激光兼容性 可用于 488 nm (蓝色)激光
规格 25 个反应
货 号 A10514

荧光补偿

当在单一实验中使用两种或更多荧光染料时,一些特定荧光染料的部分散射光谱可能会与另一种荧光染料的检测范围相重合。 为了确保荧光信号的检测具有特异性,补偿的过程就是将混入该通道的其他荧光染料的信号进行数学上的削减。 为了计算需要多少量的补偿,必须在每次实验中使用单色对照样品。 来自单一荧光染料但在其他通道里被检测得到的信号将会被检测到并通过补偿将相应的信号进行去除。 诸如 Invitrogen UltraComp eBeads、OneComp eBeads 和 AbC抗体补偿微球,或者是经过实验中所使用的抗体进行染色的细胞,都可以用作单色对照。

Spectral overlap illustration

图1: 补偿是通过数学算法对流式细胞数据进行校正来去除光谱的重叠。

补偿微球的优势

补偿微球可为流式细胞分析的补偿设置提供一种一致、准确并简易使用的工具。 一致的荧光补偿微球可帮助用户避免因使用较弱荧光样品细胞进行补偿设置时而产生的不良补偿效果。 补偿微球可在多色实验的补偿中展现出一流的实用性,并还可与实验中使用的相同抗体进行联合使用(而非例如更亮的CD4替代物)。

补偿微球适用于以下情况:

  • 需要使用较强的信号对阳性细胞群进行补偿 
  • 使用多孔板或较大规模实验时
  • 细胞量有限,不能用于补偿对照

OneComp 及 UltraComp eBeads

OneComp eBeads 是一种聚苯乙烯微球,在一管中同时含有抗体包被的阳性补偿微球以及未包被的阴性补偿微球。 单滴加样使得 eBeads 加样更为轻松。 UltraComp eBeads 微球具有与 OneComp eBeads 微球相同的优势,但经优化后更适合用于紫色激光。

了解更多关于 OneComp 及 Ultracomp eBeads的信息

UltraComp eBeads staining chart

图 2. 采用UltraComp eBeads 以及13种不同的Invitrogen eFluor 450染料偶联单克隆抗体进行染色,包括流失细胞实验中常用的每一种亚类。每种抗体取0.25 ug染色微球并通过流式细胞仪进行分析。每一组直方图代表一种染色的抗体(除大鼠IgG2a及仓鼠抗体的亚型和抗体被标注出,其他克隆及同位型在右侧进行了标注)。

 


Abc 总抗体及 ArC 胺反应补偿微球

AbC 总抗体补偿试剂盒

三种 AbC 补偿微球试剂盒含有两种类型经特异修饰的聚苯乙烯微球: 1)AbC捕获微球(也称为阳性微球),可与所有的特异性免疫球蛋白结合;2)阴性微球,不具有任何抗体结合能力。 在与偶联有荧光素的一抗(不同试剂盒可能为小鼠、大鼠、仓鼠或兔抗)进行孵育后,两种不同的补偿微球可达到完全不同的阳性和阴性微球群体用于补偿设置。 AbC 微球试剂盒设计用途是在进行阳性微球标记后再加入阴性微球,以避免在荧光逐渐向阴性微球转移。

Four histograms showing staining of the AbC™ Total Antibody Compensation Bead Kit

图 3. 展示AbC 总抗体补偿微球试剂盒染色情况的四个直方图。直方图展示了与小鼠(左上)、大鼠(右上)、仓鼠(左下)单克隆抗体以及兔(右下)单克隆和多克隆抗体结合后,阳性捕获微球与阴性微球的信号分离。捕获微球上标记有最佳量的每种PE抗体偶联物并在Invitrogen Attune声波聚焦流式细胞仪上使用 488 nm激发波长和574/26带通滤波器进行分析。

ArC 胺反应补偿微球

Invitrogen ArC 胺反应补偿微球与 AbC 总抗体补偿微球具有相同的激光兼容性并具有两管形式,但可专门用于补偿 Invitrogen LIVE/DEAD 可固定死细胞染色剂

ArC compensation bead kit histograms

图4: 采用 ArC胺反应补偿微球试剂盒以及 3种 LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒得到的染色图谱。 (A) LIVE/DEAD可固定紫色染料染色微球 在405 nm 激发发射并用 450/50 nm 带通滤波器进行收集分析。 (B) LIVE/DEAD可固定绿色染料染色微球 在488 nm 激发发射并用 525/50 nm 带通滤波器进行收集分析。 (C) LIVE/DEAD可固定红色染料染色微球 在633 nm 激发发射并用 660/20 nm 带通滤波器进行收集分析。


GFP BrightComp eBeads 补偿微球

GFP BrightComp eBeads 可在使用绿色荧光蛋白 (GFP) 时为流式细胞分析补偿设置提供一种一致、精准且易用的试剂。 该产品含有修饰过的微球,可对不同 GFP 表达水平的样品进行简单的补偿(图 5)。 每滴微球里含有阴性微球和阳性微球。标记的微球存在有 3 种水平的类 GFP 强度(图 6)。 用于 GFP 补偿的 GFP BrightComp eBeads 单滴加样使得几乎在任何流式细胞仪均可轻松使用。  

GFP BrightComp eBeads 补偿微球可用于 GFP 补偿。

图 5. GFP BrightComp eBeads 补偿微球可用于 GFP 补偿。 (A-C) 人类宫颈癌细胞系 HeLa 细胞通过 CellLight Histone 2B-GFP,BacMam 2.0转导后实现了GFP表达。 随后收集细胞并利用大鼠抗人/小鼠 CD44-PE 进行染色并在流式细胞仪上进行分析。 在流式细胞仪上采用 488 nm 激光获取数据,并采用 525/50 nm 和 585/42 nm 滤波器进行发射光谱采集。 样品进行自动补偿。 采用 GFP BrightComp eBeads 补偿微球的样品用于补偿(C) ,表明相比于采用 GFP 表达的HeLa细胞进行补偿的样品 (B)具有相同程度的补偿。

多种强度的 GFP BrightComp eBeads 补偿微球

图 6. 多种强度的 GFP BrightComp eBeads 补偿微球。 荧光蛋白可具有不同的表达水平,从而实现不同范围的荧光强度检测。 在进行补偿设置时,推荐选择相对于实验样品更高强度的微球峰。 在流式细胞仪上采用 488 nm 激光获取数据,并采用 525/50 nm 滤波器进行 GFP 发射光谱采集。