スピンカラム

スピンカラム精製は、DNA、RNA、タンパク質、プラスミド、および細胞などの分析物の分離および精製のために、分子生物学で広く使用される技法です。 スピンカラムは、遠心分離と固相抽出を組み合わせて利用し、目的の分子を複合混合物から分離します。 この方法は、そのシンプルさ、効率性、およびシーケンシング、クローニング、PCRなどのさまざまなダウンストリームアプリケーションに適した高品質の核酸サンプルを生成する能力で知られています。

スピンカラムは以下に使用できます：

• DNA抽出：高品質のゲノムDNAを細胞、組織、および血液から分離します
• RNA精製： トータルRNA、またはmRNAなどの特定のRNA種を抽出します
• プラスミドDNA精製： 細菌培養物からプラスミドDNAを精製します
• PCRクリーンアップ：PCR産物からプライマー、ヌクレオチド、および酵素を除去します
   

スピンカラムは、捕捉用に設計されたメンブレンにサンプルを通過させることでDNAを精製します。 サンプルをピペットでスピンカラムに注入し、遠心分離を使用して、カラムマトリックス中を移動させます。カラムマトリックスでは、サンプルの特定の成分がカラム内のメンブレンまたは樹脂に結合するか、洗い流されます。 pH値、イオン強度、または特別な試薬の存在など、特定の条件が提供されることで、異なる結果をもたらします。 カラムを遠心分離することにより、結合していない汚染物質は洗浄され、目的の分析物はマトリックスに結合したままとなります。 その後、特定の溶出バッファーを用いた遠心分離手順により、DNA分子などの精製された分析物が収集チューブに放出されます。

• 高い純度：DNA抽出にスピンカラムを使用すると、タンパク質、脂質、およびその他の汚染物質を効果的に除去でき、高純度の核酸を得られます。
• スピードと利便性： スピンカラムは高速に処理でき、使用が容易であるため、多くの場合30分以内にDNA精製を完了できます。
• 拡張性：スピンカラムは、少量から高スループットフォーマットまで、さまざまなサイズのサンプルからDNAを精製するのに適しています。
• 一貫性：DNA抽出用のスピンカラムは高品質の結果を提供するため、ダウンストリームアプリケーションで信頼性の高い性能を確保するのに役立ちます。

スピンカラム抽出後のDNAサンプルの純度は一般的に非常に高いため、幅広いダウンストリームアプリケーションに適しています。 ただし、正確な純度は、使用する試薬の品質、従っている特定のプロトコル、および処理しているサンプルの種類など、いくつかの要因によって左右される可能性があります。

詳細を見る：ゲノムDNA抽出

RNA精製カラムは、カオトロピック剤の存在下でRNA分子がシリカメンブレンに選択的に結合することを利用します。 スピンカラム精製の基本原則はRNAとDNAの両方で類似していますが、プロトコルや使用する試薬に重要な違いがあります（表1）。

RNA精製にスピンカラムを使用する利点には以下があります：

• 高い純度：DNA、脂質、およびその他の汚染物質を効果的に除去し、高純度のRNAを得られます。
• スピードと利便性： スピンカラムは高速に処理でき、使用が容易であるため、多くの場合30分以内にRNA精製を完了できます。
• 拡張性：少量から高スループットフォーマットまで、さまざまなサイズのサンプルからRNAを精製するのに適しています。
• 一貫性：再現性のある結果を生成し、ダウンストリームアプリケーションで信頼性の高いRNA性能を確保するのに役立ちます。

サンプル（血液、組織、細胞、植物など）は 滅菌容器に採取する必要があります。これにより、直ちに処理でき、RNaseフリー条件で保存するのに役立ちます。 RNAのスピンカラム抽出では、サンプルの細胞は機械的又は酵素的方法で破壊され、細胞を溶解します。 RNaseを不活性化するために、一般的にグアニジンイソチオシアネートが溶解バッファーに使用されます。 高品質のRNAサンプルを得るには、ライセートにDNaseを添加して混入DNAを除去し、RNA分解を防ぐためにRNase阻害剤を使用するか、サンプルを低温で保存します。

スピンカラム抽出により取得したRNAサンプルの純度は一般的に非常に高いため、RT-PCR、RNAシーケンシング、および遺伝子発現解析などの幅広いダウンストリームアプリケーションに適しています。 ただし、正確な純度は、使用する試薬の品質、従っている特定のプロトコル、および処理しているサンプルの種類など、いくつかの要因によって影響を受ける可能性があります。

細胞または組織からトータルRNAを精製する場合、高純度を期待でき、異物は最小限に抑えられます。 RNAは、RT-PCRやRNAシーケンシングなどの高感度アプリケーションに適しています。 あるいは、mRNAのスピンカラム精製では、rRNAや他の不純物質を含まない高純度のmRNAを得られるため、遺伝子発現研究やその他の分子生物学アプリケーションに最適な選択となります。

RNAの扱い
RNase汚染除去
RNase制御の基礎

DNAスピンカラムは通常シリカベースで、グアニジンなどのカオトロピック剤の存在下で核酸がシリカメンブレンに結合する能力を利用しています。 これらのカラムは一般的に、ゲノムDNAの抽出、プラスミドDNAの精製、およびPCR産物のクリーンアップに使用されます。 これらは、DNAをタンパク質、塩、およびその他の細胞デブリから分離するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供します。 PureLink Genomic DNA Kitをご覧ください。 

RNAスピンカラムはDNA精製と同様に、通常シリカマトリックスを使用します。 しかしこれらは、プロセスがRNaseフリーであることを確保するのに役立つように設計されており、RNAを分解から保護します。 多くの場合RNA抽出のプロトコルはより厳格で、RNaseを不活性化するための手順が含まれます。 これらのカラムは、トータルRNAの分離、mRNAの精製、およびマイクロRNA抽出に使用され、遺伝子発現研究やトランスクリプトミクスで不可欠になっています。 GeneJETスピンカラムをご覧ください。 

タンパク質スピンカラムは、標的タンパク質を捕捉する特定のリガンドを使用するアフィニティーベース、または電荷に基づいてタンパク質を分離するイオン交換ベースです。 アフィニティーカラムは通常、ヒスチジンタグ化タンパク質に結合するNi-NTA（ニッケル-ニトリロ三酢酸）、またはGSTタグ化タンパク質に結合するGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）などの材料を特徴としています。 これらのカラムは、タンパク質の構造研究、酵素アッセイ、または抗体生成のためのタンパク質精製に重要です。 Pierceスピンカラムをご覧ください。

細胞用に設計されたスピンカラムは通常、特定の細胞集団を濃縮または分離するのに使用されます。 これらは磁気ビーズまたはアフィニティーリガンドを利用して、特定の表面マーカーを有する細胞を捕捉するため、選択的な分離を可能にします。 これらのカラムは、免疫学研究や腫瘍学研究など、精製された細胞集団を必要とするワークフローで使用されます。 Pierce Cell Surface Biotinylation Kitをご覧ください。 

プラスミドDNA分離は分子クローニングの一般的な手順です。 プラスミド抽出用に設計されたスピンカラムはシンプルなアルカリ性溶解手順を可能し、その後、プラスミドDNAはシリカメンブレンに結合します。 これらのカラムは、トランスフェクション、クローニング、またはシーケンシングに適した非常に高純度のプラスミドDNAを提供します。 PureLink Genomic DNA Mini Kitをご覧ください。 

シリカメンブレンカラムは、核酸分離に広く使用されるスピンカラムの一種です。 カオトロピック条件下では、核酸はシリカメンブレンにしっかりと結合しますが、タンパク質やその他の汚染物質は結合しません。 これらのカラムは、ゲノムDNA、プラスミドDNA、およびRNAの精製に使用されます。

イオン交換カラムは、分子間の電荷の違いを利用することで機能します。 陰イオン交換および陽イオン交換マトリックスは、タンパク質、DNA、またはその他の電荷分子を精製するのに使用されます。 これらのカラムは、構造生物学的研究など、高い純度が必要な場合に特に便利です。

アフィニティースピンカラムは、高い選択性で生体分子を特異的に捕捉するように設計されています。 たとえば、Ni-NTAカラムはHisタグ化タンパク質の精製に使用され、不活化抗体を用いたカラムは特定のタンパク質を捕捉できます。 これらのカラムは一般的に、タンパク質精製、免疫沈降、および抗体分離で使用されます。

ゲルろ過またはサイズ除外カラムは、サイズに基づいて分子を分離します。 より大きな分子は早期に溶出し、より小さな分子はマトリックスを通過するのに長い時間を要します。 これらのカラムは主に、バッファー交換、脱塩、またはヌクレオチドや塩などのより小さな汚染物質からタンパク質を分離するのに使用されます。

磁気ビーズカラムは、磁気ビーズによる分離の特異性とスピンムカラムの利便性を組み合わせています。 ビーズは、標的分析物に結合する特定のリガンドまたは抗体でコーティングされており、その後、標的分析物は磁気を使用して分離されます。 これらのカラムは、複合サンプル中の細胞、タンパク質、または核酸を精製するのによく使用されます。 Dynabeads磁気ビーズは磁気ビーズベース分離の一例で、その結果は研究業界において複数のアプリケーション領域でよく引用されています。

Dynabeads磁気分離技術の詳細を見る。

• DNAシーケンシングおよびジェノタイピング： スピンカラムは、シーケンシング、制限消化、およびその他のジェノタイピング技法用 にDNAを精製します。
• クローニングおよび遺伝子発現： プラスミド精製カラムは、クローニングワークフローにおいて重要です。
• タンパク質の構造および機能研究： アフィニティおよびイオン交換カラムは、X線結晶学、NMR、および酵素的アッセイ用にタンパク質を精製します。
• RNA発現プロファイリング： RNAスピンカラムは、トランスクリプトーム分析用の高品質のRNAを分離できます。
• 細胞ベースのアッセイ： 細胞分離カラムは、免疫沈降、フローサイトメトリー、および エキソソーム解析に使用されます。

スピンラカムのワークフローはシンプルであるにもかかわらず、低回収量、汚染、または不完全結合などの問題が時々起こる可能性があります。 主なトラブルシューティング戦略には以下があります：

• バッファー条件を調整する： 使用するバッファーが特定の分析物およびマトリックスに対して適切であることを確認してください。
• 遠心分離の速度と時間の最適化する： 遠心分離が不十分であると、分離が不完全になる可能性がある一方、過度な力は分析物を損傷する可能性があります。
• 適切なサンプル調製を維持する： 元々のサンプルに、結合を妨げる可能性のある汚染物質が含まれていないことを確認してください。