Pierce™ Direct IP Kit

Das Thermo Scientific Pierce Direkt-IP-Kit verwendet ein aktiviertes Harz, um IP-Antikörper (jede Art oder Klasse) auf Agarose-Beads ohne Hilfe von Protein A/G kovalent zu immobilisieren und so eine Immunpräzipitation ohne Antikörperinterferenzen zu ermöglichen.

Die primären Vorteile dieser Methode bestehen in der Möglichkeit, alle Arten und Klassen von gereinigten Antikörpern (nicht nur solche, die an Protein A oder G binden) zu verwenden, und in der Fähigkeit, Zielproteine ohne Antikörper-Verunreinigungen zu reinigen. Darüber hinaus gestattet es diese Methode, die Immunpräzipitation von Antigenen aus Serumproben durchzuführen, ohne gleichzeitig auch Nichtziel-Immunglobuline mitzureinigen. Und schließlich stellt das Kit Mikrozentrifugenbecher bereit, die eine effektive Wäsche der Proben und Trennung von den Agaroseharz-Beads gestatten.

Merkmale des Direkt-IP-Kits:

• Erfordert weniger als 10 µg Antikörper— optimiertes Verfahren erfordert nur 2 bis 10 µg Antikörper für ein einzelnes IP-Experiment, nicht mehr als herkömmliche IP-Methoden
• Leichte und effiziente Skalierbarkeit— verwenden Sie nur die Antikörpermenge, die für eine einzige Immunpräzipitation benötigt wird, oder immobilisieren Sie 100 bis 200 µg Antikörper zur Vorbereitung eines gebrauchsfertigen IP-Affinitätsharzes für eine Vielzahl von Experimenten
• Minimale Antikörperkontamination— dank der irreversiblen Bindung des Antikörpers an die Agarose-Beads wird die Co-Elution von leichten und schweren Ketten mit dem gereinigten Protein minimiert (unter 5 %)
• IP mit allen Arten und Subklassen von Antikörpern— verwenden Sie Huhn-IgY, humanes IgE, Maus-IgM oder jedes andere gereinigte Protein
• Vorbereitetes Antikörper-Affinitätsharz ist wiederverwendbar— aufgrund des kovalent immobilisierten Antikörpers, der durch das schonende Elutionsverfahren in der Regel nicht inaktiviert wird, kann das Harz in vielen Fällen mehrmals verwendet werden.
• Praktische Probenhandhabung— die Spin-Säulen (siehe Abmessungen) beseitigen Harzverluste und sorgen für eine effiziente Trennung von Lösungen
• Komplett-Kit— im Lieferumfang der Packungen sind Zelllysepuffer und ausreichende Reagenzien und Spin-Säulen enthalten, um mindestens 50 Antikörper-Immobilisierungen und IP-Experimente durchzuführen
• Erfordert gereinigte Antikörper— die IP Antikörper-Lösung darf weder BSA noch Gelatine oder andere als Stabilisator eingesetzte Proteine enthalten; zur leichten Entfernung solcher Proteine siehe unser Antikörperaufreinigungskit (Art.Nr. 44600)

Anwendungen:
• Immunpräzipitation, gefolgt von Elektrophorese und Exzision des Proteins für die Massenspektrometrie oder Bestimmung mittels Sequenzanalyse
• Immunpräzipitation und SDS-PAGE-Analyse eines Zielproteins, dessen Molekulargewicht ähnlich schwer ist wie die leichten oder schweren Ketten des Antikörper-Fragments
• Immunpräzipitation der Zielproteine für die nachfolgende Analyse mit nicht denaturierenden Methoden (d. h. Methoden, die nicht auf SDS-PAGE beruhen)
• Immunpräzipitation mit Antikörpern, die nicht an Protein A, Protein G oder Protein A/G binden
• Immunpräzipitation aus Serum und anderen Proben, die Immunglobuline enthalten

Direkte Immunpräzipitation in zwei einfachen Schritten:

Schritt 1: Konjugation der Antikörper an Agarose-Harz: Der erste Schritt der direkten IP-Methode besteht in der Vorbereitung des IP-Antikörper-Affinitätsharzes. Dabei werden gereinigte Antikörper (siehe Highlights) in Phosphatpuffer mit einer ausreichenden Menge an AminoLink Plus Kopplungsharz, d. h. Aldehyd-aktiviertem Agarose-Harz in Bead-Form, inkubiert. Während der Inkubation reagieren unterschiedliche Epsilon-Amino-Gruppe von Lysin auf der Oberfläche großer Antikörper-Moleküle mit den Aldehyd-Gruppen auf dem Harz, wobei Schiff-Base-Bindungen entstehen, die anschließend durch die Präsenz von Cyanoborhydrid zu sekundären Aminbindungen stabilisiert werden. Die als reduktive Aminierung bekannte Immobilisierungsreaktion ist nicht denaturierend, wobei der Wirkungsgrad der Antikörperkopplung in der Regel mehr als 85 % beträgt und nur minimale Verluste der Antigen-Bindungsfunktion zu beobachten sind.

Schritt 2: Durchführung der Immunpräzipitationsexperimente: Nach Vorbereitung des Antikörperharzes kann dieses in verschiedenen parallelen Aliquoten oder in seiner Gesamtheit zu IP-Experimenten verwendet werden. Das Antikörperharz wird mit einer Probe inkubiert, die das interessieren Proteinantigen enthält, damit sich der Antikörper:Antigen-Komplex bilden kann. Nach einem Waschverfahren zur Entfernung nicht gebundener (vermutlich unerwünschter) Bestandteile der Probe wird das Antigen durch die Dissoziation vom Antikörper mit dem Elutionspuffer des Kits wiedergewonnen. Das gesamte Verfahren erfolgt in einem Mikrozentrifugen-Becher, wodurch Lösungen nach einer kurzen Zentrifugation vollständig vom Agaroseharz getrennt werden. Durch das Verfahren wird nur Antigen eluiert, das ohne Störungen durch Antikörperfragmente identifiziert und weiter analysiert werden kann. Darüber hinaus kann das Antikörper-Harz oft für weitere Immunpräzipitationsläufe wiederverwendet werden.

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