Thermo Scientific Pierce Sulfo-SBED Biotin-Markierungstransferreagenz für die Biotinmarkierung ist ein multifunktionales Reagenz zur Markierung eines aufgereinigten Proteins und anschließender kovalenter Übertragung des angehängten Biotin-Tags auf bestimmte Akteure dieses Proteins.

Sulfo-SBED ist die Abkürzung für Sulfo-N-Hydroxysuccinimidyl-2-(6-[Biotinamido]-2-(p-azido benzamido)-Hexanoamido) ethyl-1,3'-Dithioproprionat. Es ist ein heterobifunktionaler chemischer Crosslinker, der sich an einem Ende kovalent an primäre Amine und am anderen Ende an nahezu jede funktionelle Proteingruppe anbindet. Im Gegensatz zu typischen Crosslinkern enthält Sulfo-SBED auch eine Biotin-Gruppe und einen spaltbaren Disulfid-Spacerarm. Zusammen ermöglichen diese Merkmale es, interagierende Proteine sequentiell zu vernetzen und das Biotin-Affinitätstag von einem Protein (d. h. einem aufgereinigten Köderprotein) auf ein anderes (möglicherweise unbekanntes Beuteprotein) zu übertragen. Der Markierungstransfer ist eine leistungsfähige In-vitro-Methode für die Bestimmung von Proteininteraktionen. Eine wachsende Publikationszahl beschreibt den Gebrauch von Sulfo-SBED Biotin-Markierungstransferreagenz für die Biotinmarkierung zum vorherigen Identifizieren unbekannter Proteinwechselwirkungspartner und umfassenden Charakterisieren spezifischer Proteinbindungsdomänen anderer Proteininteraktionen.

Typisches Protokoll für ein Markierungstransferexperiment:

• Einige Mikroliter gelöstes Sulfo-SBED Reagenz zu 0,5 bis 1 ml aufgereinigtem Köderprotein in PBS hinzugeben.
• Die Mischung 30 bis 120 Minuten auf Eis oder bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
• Entsalzen oder dialysieren (bei gedämpftem Licht), um überschüssiges, nicht reagiertes Sulfo-SBED aus dem markierten Köderprotein zu entfernen.
• Fügen Sie markiertes Köderprotein zu Zelllysat oder einer anderen Lösung hinzu, die vermeintliche Zielproteininteraktoren („Beute“) enthält.
• Wenn sich Interaktionskomplexe gebildet haben, die Lösung mehrere Minuten lang ultraviolettem Licht (365 nm) aussetzen.
• Analysieren Sie Produkte mit einer der folgenden Methoden:
• Western Blot: Vernetzungen in DTT spalten, Proteine durch SDS-PAGE trennen und biotinylierte Banden durch Western Blot mit Streptavidin-HRP nachweisen.
• Aufreinigung und Massenspektrometrie oder Sequenzierung: Affinitätsaufreinigung biotinylierter Proteine oder Peptidfragmente nach Trypsinverdau und Durchführung von MS oder Sequenzierung zur Charakterisierung der beteiligten Proteine.

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