Das Thermo Scientific Pierce Sulfo-SBED Biotin Label Transfer Reagent ist ein multifunktionales Reagenz zur Markierung eines aufgereinigten Proteins und anschließender kovalenter Übertragung des angehängten Biotin-Tags auf bestimmte Interaktoren dieses Proteins.

Sulfo-SBED ist die Abkürzung für Sulfo-N-hydroxysuccinimidyl-2-(6-[biotinamido]-2-(p-azido benzamido)-hexanoamido) ethyl-1,3'-dithioproprionat. Es ist ein heterobifunktionaler chemischer Crosslinker, der sich an einem Ende kovalent an primäre Amine und am anderen Ende an nahezu jede funktionelle Proteingruppe anbindet. Im Gegensatz zu typischen Crosslinkern enthält Sulfo-SBED auch eine Biotin-Gruppe und einen spaltbaren Disulfid-Spacerarm. Zusammen ermöglichen diese Merkmale es, interagierende Proteine sequentiell zu vernetzen und das Biotin-Affinitätstag von einem Protein (d. h. einem aufgereinigten Köderprotein) auf ein anderes (möglicherweise unbekanntes Beuteprotein) zu übertragen. Der Labeltransfer ist eine leistungsfähige In-vitro-Methode für die Erforschung von Proteininteraktionen. Eine wachsende Zahl von Publikationen beschreibt den Gebrauch des Sulfo-SBED Biotin Label Transfer Reagent, um vorher unbekannte Proteinwechselwirkungspartner zu identifizieren und die spezifischen Proteinbindungsdomänen anderer Proteininteraktionen umfassender zu charakterisieren.

Typisches Protokoll für Label-Transfer-Experiment:

• Geben Sie ein paar Mikroliter gelöstes Sulfo-SBED Reagenz zu 0,5 – 1 ml aufgereinigtem Köderprotein in PBS.
• Die Mischung 30 bis 120 Minuten auf Eis oder bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
• Entsalzen oder dialysieren (bei gedämpftem Licht), um überschüssiges, nicht reagiertes Sulfo-SBED von dem markierten Köderprotein zu entfernen.
• Fügen Sie markiertes Köderprotein zum Zelllysat oder einer anderen Lösung hinzu, die vermeintliche Zielproteininteraktoren („Beute“) enthält.
• Wenn sich Interaktionskomplexe gebildet haben, setzen Sie die Lösung für mehrere Minuten ultraviolettem Licht (365 nm) aus.
• Analysieren Sie Produkte mit einer der folgenden Methoden:
• Western Blotting: Kreuzverbindungen in DTT spalten, Proteine durch SDS-PAGE trennen und biotinylierte Banden durch Western Blotting mit Streptavidin-HRP nachweisen.
• Aufreinigung und Massenspektrometrie oder Sequenzierung: Affinitätsreinigung biotinylierter Proteine oder Peptidfragmente nach Trypsin-Verdauung und Durchführung von MS oder Sequenzierung zur Charakterisierung der beteiligten Proteine.

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