CloneJET PCR-Klonierungskit

Beim Thermo Scientific CloneJET PCR Klonierungskit, das auch mit DH10B Zellen verfügbar ist (K123120), handelt es sich um ein leistungsstarkes System zur Positivselektion für die hocheffiziente Klonierung von PCR-Produkten, die mit einer beliebigen thermostabilen DNA-Polymerase hergestellt wurden. Beliebige andere DNA-Fragmente mit glatten (Blunt End) oder überhängenden Enden (Sticky-End) können kloniert werden. Das Kit ist ideal für phosphorylierte oder nicht-phosphorylierte DNA-Fragmente. Die Ligation in den beiliegenden Vektor zur Positivselektion dauert nur 5 min und führt zu einer Ausbeute von über 99 % rekombinanter Klone. Die mit einem Proofreading-Enzym hergestellten PCR-Produkte mit stumpfen Ende werden direkt in den Klonierungsvektor ligiert.

PCR-Produkte, die mit Non-Proofreading-DNA-Polymerasen (z. B. Taq-Polymerase) oder DNA Polymerase-Mischungen hergestellt wurden, werden vor der Ligation 5 Minuten lang mit dem im Kit enthaltenen thermostabilen DNA-Blunting-Enzym inkubiert. Alle im Labor üblichen E. coli-Stämme können direkt mit dem Ligationsprodukt transformiert werden.

Merkmale

Das CloneJET PCR Klonierungskit enthält den neuen, gebrauchsfertigen Klonierungsvektor pJET1.2/Blunt zur positiven Selektion. Der Vektor enthält ein letales Restriktionsenzymgen, das durch Ligation eines DNA-Inserts in die Klonierungsstelle unterbrochen wird. Dementsprechend können nur Bakterienzellen mit rekombinanten Plasmiden Kolonien bilden. pJET1.2/blunt-Vektormoleküle nach Ringschluss, die kein Insert vorweisen, exprimieren ein letales Restriktionsenzym, wodurch die E. coli-Wirtszelle nach der Transformation abgetötet wird. Diese Positivselektion führt zu einer deutlichen Beschleunigung des Kolonie-Screenings und verhindert die Entstehung weiterer Kosten durch die Blau-Weiß-Selektion.

Um die Kartierung und Handhabung des Inserts einfacher zu gestalten, enthalten die Klonierungsstellen des Klonierungsvektors pJET1.2/Blunt zwei BglII-Erkennungssequenzen, die die Insertionsstelle von beiden Seiten eingrenzen. Darüber hinaus enthält der Vektor einen T7-Promoter für die In vitro- und In vivo-Transkription sowie die Sequenzierung des Inserts.

Vorteile

• Schnell – PCR-Klonierung in nur 5 Minuten
• Höchste Effizienz – > 99 % positive Klone
• Kein Klonierungshintergrund – Vektor zur Positivselektion
• Vielseitig – Ideal für die Klonierung mit stumpfem oder überhängendem Ende
• Wirtschaftlich – Kein kostenintensives Blau-Weiß-Screening

Anwendungen

•Klonierung von PCR-Produkten mit stumpfem Ende oder 3-dA-Schwanz bis zu 10 kb
• Klonierung von DNA-Fragmenten, die mit Restriktionsenzymen hergestellt wurden
• Sequenzierung klonierter DNA
• In-vitro- und In-vivo-Transkription klonierter Inserts vom T7-Promoter

Enthält

• Klonierungsvektor pJET1.2/blunt
• T4 DNA-Ligase
• 2X Reaktionspuffer
• DNA-Blunting-Enzym
• pJET1.2 Vorwärtssequenzierungsprimer (5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3')
• pJET1.2 Rückwärtssequenzierungsprimer (5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3'
• PCR-Produkt zur Kontrolle
• Wasser, nukleasefrei
• Detailliertes Protokoll

Das Ligationsgemisch muss vor der Elektroporation in einer Säule aufgereinigt, z. B. mit dem GeneJet PCR-Aufreinigungskit #K0701 oder mit Chloroform extrahiert werden. Die Elektroporation wird in der Gegenwart von Proteinen und Salzen im Gemisch gehemmt.

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