Premo Autophagiesensoren nutzen die Autophagie-assoziierten Proteine LC3B oder p62 zusammen mit GFP oder RFP, um entweder die Induktion oder Hemmung der Autophagie in Zellen nachzuweisen. Premo Autophagiesensoren werden mit BacMam (Insekten Baculovirus mit Mammalin (Säugetier)-Promotor)-Technologie transduziert, was eine eindeutige Visualisierung der chimärischen Proteine in Autophagosomen ermöglicht. BacMam Reagenzien sind nicht-replizierend in Säugetierzellen und daher sicher handhabbar. Sie sind auch nicht zytotoxisch und gebrauchsfertig. Im Gegensatz zu herkömmlichen Expressionsvektoren ermöglichen BacMam Reagenzien titrier- und reproduzierbare Expression und bieten eine hohe Co-Transduktionseffizienz, sodass mehrere BacMam Reagenzien leicht in der selben Zelle verwendet werden können. Die kürzlich am BacMam System vorgenommenen Verbesserungen ermöglichen eine effiziente Transduktion in einer größeren Vielfalt von Zellen, einschließlich Neuronen und neuronalen Stammzellen (NSCs), mit einem einfachen, einstufigen Protokoll. Zur Visualisierung der Autophagie fügen Sie den BacMam Autophagiesensor einfach in die Zellen ein und inkubieren über Nacht für die Proteinexpression. Anschließend lässt sich das Signal mithilfe der standardmäßigen GFP- und/oder RFP-Fluoreszenzeinstellungen auf Ihrem Gerät nachweisen.

Das LC3B-Protein spielt eine entscheidende Rolle bei der Autophagie. Normalerweise befindet sich dieses Protein im Zytosol, aber nach Spaltung und Lipidierung mit Phosphatidylethanolamin bindet sich LC3B an den Phagophor. Diese Lokalisierung kann als allgemeiner Marker für autophagische Membranen verwendet werden. Das p62-Protein, auch als Sequestosom (SQSTM1) bezeichnet, ist ein Ubitiquitin-bindendes Protein, das als Rezeptor für Cargo dient, das von den Autophagiemechanismen der Zelle abgebaut werden soll. Wenn Autophagie induziert wird, lokalisiert das p62-Protein die Autophagosome und wird anschließend abgebaut. Umgekehrt sammelt sich bei einer Hemmung der Autophagie das p62-Protein im Autophagosom an. So dient die subzelluläre Lokalisierung einer fluoreszierenden p62-Protein-Chimäre als nützlicher Marker für die Induktion und Hemmung der Autophagie.

Durch die Kombination des säureempfindlichen GFP (d. h. Emerald GFP) mit einem säureunempfindlichen RFP (d. h. TagRFP) im Tandemsensor RFP-GFP-LC3B kann der Wechsel von einem Autophagosom (pH-neutral) zu Autolysosom (saurer pH-Wert) visualisiert werden, und zwar durch Darstellung des spezifischen GFP-Fluoreszenzverlustes nach Azidifikation des Autophagosoms nach lysosomaler Fusion. Nach der Induktion der Autophagie markiert der Premo Autophagie-Tandem-Sensor die punktförmigen Autophagosome; diese Strukturen sind sowohl für GFP als auch für RFP positiv. Sobald das Lysosom fusioniert ist, sinkt der pH-Wert, wodurch das GFP-Volumen erreicht wird und die Autolysosomen rot erscheinen lässt. Darüber hinaus ermöglicht die Kombination des Premo Autophagie-Tandem-Sensors mit dem dunkelrot emittierenden LysoTracker Deep Red (separat erhältlich) eine dreifarbige Analyse der Dynamik von Autophagosomen, Autolysosomen und Lysosomen.

Jedes Premo Autophagie-Assay-Kit enthält Chloroquin-Diphosphat, das als Negativkontrolle zur Hemmung der Autophagie dient.

Vorteile der Verwendung von Premo Autophagie-Assays
• Multiplex-inspiriert: Durch Kombination des Premo Autophagie-Tandem-Sensors mit dem LysoTracker Deep Red, das Licht im dunkelroten Bereich emittiert, wird eine Drei-Farben-Analyse der kompletten Dynamik des Autophagieprozesses ermöglicht
• Hochgradig effizientes Einbringen:> 90 % Transduktion bei einer Vielzahl von Säugetierzelllinien, einschließlich Primärzellen, Stammzellen und Neuronen
• Schnell und bequem: Das Premo Autophagie-Reagenz einfach auf Ihre Zellen geben, über Nacht inkubieren, und Ergebnis visualisieren – oder Assay-fertige Zellen zur späteren Verwendung einfrieren
• Robust: Premo Autophagie-Reagenzien sind nicht replizierend in Säugetierzellen, haben keine wahrnehmbare zellschädigende Wirkung und eignen sich für den Umgang auf Protokollen der Biosicherheitsstufe (BSL) 1
• Mehrere Konfigurationen: – Premo Autophagiesensoren sind in den folgenden chimären Konfigurationen erhältlich:
P36235: LC3B-GFP; Kontrolle LC3B (G120A)-GFP; P36236: LC3B-RFP; Kontrolle LC3B (G120A)-RFP; P36239: RFP-GFP-LC3B; P36240: GFP-p62; P36241: RFP-p62