Kit d’IP/Co-IP magnétique par réticulation Pierce™

Le kit IP / Co-IP magnétique pour réticulation Pierce Thermo Scientific utilise la chimie de réticulation pour immobiliser de manière covalente les anticorps IP sur des microbilles magnétiques de protéine A / G de qualité supérieure pour une immunoprécipitation et une co-immunoprécipitation efficaces.

Comme cette procédure d’immunoprécipitation magnétique implique l’adhérence covalente de l’anticorps spécifique utilisé pour l’immunoprécipitation, les protéines ou complexes protéiques de co-immunoprécipitation cibles peuvent être élués et analysés sans fragments d’anticorps, car l’anticorps reste fixé sur les microbilles. Le kit contient un protocole optimisé et tous les tampons et réactifs nécessaires pour réaliser une immunoprécipitation ou une co-immunoprécipitation à haut rendement avec des anticorps qui se lient à la protéine A/G et en utilisant des outils de séparation magnétique manuels ou automatisés.

Caractéristiques du kit IP/Co-IP magnétique pour réticulation :

• Immunoprécipitation sans anticorps : l’anticorps est fixé de manière irréversible aux microbilles magnétiques, ce qui entraîne une co-élution négligeable de l’anticorps intact ou des chaînes lourdes et légères avec l’antigène purifié
• Pratique : le kit d’immunoprécipitation / co-immunoprécipitation contient des microbilles magnétiques et tous les tampons essentiels pour une immunoprécipitation optimale
• Rapide : réticulation et immunoprécipitation complètes en moins de 3 heures
• Efficace : effectuez une immunoprécipitation avec la moitié du volume recommandé de particules magnétiques par rapport à d’autres microbilles magnétiques
• Compatible : les microbilles magnétiques couplées à la protéine recombinante de protéine A / G assurent la compatibilité avec la plupart des anticorps primaires, qu’ils soient de souris ou de lapin
• Évolutif : utilisez uniquement la quantité d’anticorps nécessaire pour une seule expérience d’immunoprécipitation ou préparez une plus grande quantité de microbilles magnétiques réticulées par anticorps pour plusieurs expériences

Le protocole du kit IP / Co-IP magnétique pour réticulation Pierce lie l’anticorps IP aux microbilles magnétiques de protéine A / G, puis réalise la réticulation covalente de l’anticorps aux microbilles à l’aide du subérate de disuccinimidyle (DSS). Les microbilles réticulées par anticorps sont incubées avec du lysat cellulaire ou de l’extrait tissulaire contenant l’antigène protéique d’intérêt, permettant la formation d’un complexe anticorps-antigènes. Les microbilles sont lavées pour éliminer les matériaux non liés et un tampon d’élution à faible pH est utilisé pour dissocier l’antigène lié des microbilles réticulées par anticorps. Le tampon de neutralisation est inclus pour empêcher la précipitation de l’antigène isolé et assurer l’activité des protéines dans les applications en aval. Le tampon d’échantillonnage avec marqueur de piste est inclus pour la préparation des échantillons pour l’analyse SDS-PAGE. Le protocole est optimisé pour 2 à 10 µg d’anticorps IP. Pour des rendements de co-immunoprécipitation optimaux, utilisez 5 à 10 µg d’anticorps. Les microbilles sont retirées de la solution manuellement à l’aide d’un support magnétique ou automatiquement avec un instrument tel que le KingFisher Flex Thermo Scientific.

La méthode IP classique (sans adhérence d’anticorps par covalence) fournit généralement des rendements d’antigènes plus élevés que les protocoles IP utilisant la réticulation. Ceci est dû au processus de réticulation qui entraîne inévitablement la perte de certains sites de liaison des anticorps fonctionnels. Pour surmonter cette limitation avec la méthode de réticulation, il faudra utiliser des quantités légèrement plus élevées d’anticorps IP dans la méthode IP de réticulation que dans la procédure IP classique équivalente. Cependant, l’avantage de la procédure d’immunoprécipitation réticulée est que les transferts Western sont exempts de bandes d’anticorps interférentes.

Résumé du protocole
1 : Prélavez les microbilles avec 1 tampon de couplage.
2 : Liez l’anticorps aux microbilles magnétiques de protéine A / G pendant 15 minutes.
3 : Lavez les microbilles trois fois avec 1 tampon de couplage.
4 : Réticulez les anticorps aux microbilles par DSS pendant 30 minutes.
5 : Lavez les microbilles trois fois avec le tampon d’élution, puis deux fois avec le tampon de lyse/lavage IP.
6 : Incubez le lysat cellulaire avec des microbilles préparées pendant 1 à 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4°C.
7 : Lavez les microbilles deux fois avec le tampon de lavage/lyse IP, puis une fois avec de l’eau purifiée.
8 : Antigène lié à l’élution.

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