La phosphatase alcaline thermosensible Thermo Scientific FastAP catalyse la libération des groupes de 5’- et 3’-phosphates de l’ADN, de l’ARN et des nucléotides. Cette enzyme élimine également les groupes phosphate des protéines.

FastAP est une nouvelle phosphatase alcaline active dans tous les tampons d’enzymes de restriction Thermo Scientific ainsi que dans les tampons de PCR. Elle déphosphoryle tous les types d’extrémités d’ADN (franches, en saillies de 5’ et 3’) en 10 minutes à 37°C. L’enzyme est inactivée en 5 minutes à 75°C (voir Figure 1 dans les données à l’appui). Par conséquent, l’élimination de la phosphatase alcaline n’est pas requise avant la ligature.

Points clés

• Enzyme recombinante
• Déphosphorylation rapide : 10 minutes à 37°C
• Inactivation rapide et complète : 5 minutes à 75°C
• Digestion simultanée et déphosphorylation de l’ADN vecteur
• 100 % active dans l’enzyme de restriction et les tampons de PCR
• Purification PCR en conjonction avec Exo I
• Déphosphorylation des protéines

Un seul protocole pour tous les types d’extrémités d’ADN :
• Saillies de 5’ 
• Saillies de 3’ 
• Extrémités franches
• nucléotides simples

Applications

• Déphosphorylation de l’ADN vecteur de clonage pour empêcher la recircularisation pendant la ligature
• Digestion et déphosphorylation simultanées de l’ADN vecteur
• Purification des produits de PCR : détérioration des nucléotides avant le séquençage des produits de PCR
• Déphosphorylation des terminaisons 5’ des acides nucléiques avant le marquage à l’aide de la polynucléotide kinase T4 
• Autres applications dans lesquelles la déphosphorylation des substrats d’ADN et d’ARN est nécessaire
• Déphosphorylation des protéines

Remarque

• La liaison de la phosphatase alcaline thermosensible FastAP à l’ADN peut entraîner un décalage des bandes dans les gels d’agarose. Pour éviter cela, incubez les échantillons avec une solution de colorants de charge d’ADN 6X et SDS à 65°C pendant 10 minutes et refroidissez-les sur de la glace avant l’électrophorèse.
• La phosphatase alcaline thermosensible FastAP est active sur les tampons d’enzyme de restriction et peut être ajoutée directement à l’ADN digéré. L’inactivation par la chaleur de l’enzyme de restriction avant la réaction de déphosphorylation n’est pas nécessaire.