Données d’échantillons du système de quantification fluorimétrique Qubit

Performances et données d’application pour la quantification fluorimétrique Qubit

Les données d’échantillons sur la quantification de l’ADN, la quantification de l’ARN, l’intégrité et la qualité (IQ) de l’ARN, la quantification de protéines et la détection d’endotoxines démontrent que les données générées avec les dosages Qubit sur des fluorimètres Qubit sont exactes, précises, sensibles et sélectives.

Données de quantification de l’ADN

Exactitude et précision

Exactitude et précision des fluorimètres Qubit. L’exactitude a été évaluée sous la forme d’un écart moyen par rapport à la concentration réelle à l’aide du dosage de l’ADNdb HS Qubit, tandis que la précision a été évaluée sous la forme du coefficient de variation (CV) des réplicats de diverses concentrations à l’aide du dosage de l’ADNdb BR Qubit. Les faibles pourcentages d’écart démontrent l’exactitude des fluorimètres Qubit Flex et Qubit 4, tandis que les faibles pourcentages de CV démontrent leur précision, en particulier le modèle Qubit Flex. Parmi les trois instruments testés, l’instrument concurrent avait l’exactitude et la précision les plus faibles.

Exactitude et sensibilité

Exactitude et sensibilité du dosage d’ADNdb Qubit par rapport à l’absorbance UV. Dix réplicats d’ADN lambda à des concentrations connues comprises entre 0,01 et 10 ng/μl ont été analysés à l’aide du dosage ADNdb HS Qubit sur le fluorimètre Qubit (barres bleues) conformément au protocole de kit standard. Les mêmes concentrations d’ADN ont été mesurées par absorbance UV dans 10 réplicats à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume (barres bleues). On a ensuite comparé l’exactitude et la précision des résultats. Chaque barre représente la moyenne de 10 réplicats, tandis que les barres d’erreur (presque indiscernables pour les mesures Qubit) représentent leurs écarts-types. L’échelle de l’axe des X représente les concentrations connues d’ADN dans les échantillons de départ, avant dilution dans les tubes de dosage Qubit, tandis que l’échelle de l’axe des Y montre les concentrations mesurées. Les mesures du fluorimètre Qubit étaient plus précises (y » x), sensibles (faibles concentrations, encart) et précises (barres d’erreur beaucoup plus petites) que les mesures d’absorbance UV.

Sensibilité et sélectivité

Sensibilité et sélectivité du dosage d’ADNdb HS Qubit

Le dosage de l’ADNdb HS Qubit a donné des résultats linéaires précis pour des quantités connues et croissantes d’ADNdb (cercles verts), même en faibles quantités (encart, en agrandissant l’extrémité très basse de l’échelle). Ces mesures spécifiques à l’ADN n’ont été que légèrement affectées par l’ARN ajouté seul (triangles rouges) ou en association avec l’ADN (carrés bleus).

B) Dosage de l’ADNdb HS Qubit 1X

B) Dosage de l’ADNdb BR Qubit 1X

Sélectivité des dosages (A) ADNdb HS et (B) BR 1X Qubit

Les tracés montrent les résultats de quantification pour les échantillons ensemencés avec des quantités connues d’ADN et d’ARN par rapport aux valeurs attendues. Les cercles représentent des échantillons avec 10 μl d’ADN plus 190 μl de solution de travail, à des concentrations variables. Les carrés représentent des échantillons avec 10 μl d’ARN et 10 μl d’ADN plus 180 μl de solution de travail, à des concentrations variables. La proximité des cercles et des carrés, qui est presque indiscernable dans certains cas, démontre que ces deux dosages d’ADNdb sont peu affectés par la présence d’ARN.

Données de quantification de l’ARN

Exactitude et sélectivité

Qubit RNA and microRNA assays

Exactitude et sélectivité des dosages ARN et microARN Qubit. L’ARN ribosomique (ARNr) aux concentrations indiquées sur l’axe des X a été ajouté aux échantillons contenant 2 μg/ml de siRNA. Les mélanges ont ensuite été analysés avec le dosage de microARN Qubit, le dosage d’ARN Qubit et le dosage NanoDrop A260, qui quantifie l’absorption UV. La moyenne des résultats des huit réplicats a été établie, avec des écarts-types indiqués. La limite de détection de l’instrument NanoDrop (barres violettes) pour la concentration totale d’ARN est de 1,5 μg/ml, ce qui affecte son exactitude et sa précision aux faibles niveaux de concentration. Le dosage d’ARN Qubit (barres rouges) a quantifié avec précision la concentration de l’ARNr sur une grande échelle. Le dosage de microARN Qubit (barres bleues) a quantifié avec précision la concentration de siRNA de 2 μg/ml, tandis que l’exactitude a été légèrement affectée lorsque l’ARNr a augmenté de 2 à 5 fois cette quantité. Les tendances bleues et rouges indiquent les concentrations réelles de siRNA et d’ARNr dans les échantillons, respectivement.

Exactitude, précision et sensibilité

Exactitude, précision et sensibilité des dosages de microARN Qubit. Six expériences ont été menées pour tester l’exactitude et la précision du dosage de microARN Qubit avec du siRNA pur ; les résultats d’une expérience typique sont présentés ici. Dans cette expérience, huit réplicats de GAPDH siRNA à des concentrations connues de 0,1 μg/ml à 12 μg/ml ont été mesurés à l’aide du kit de dosage de microARN Qubit avec le fluorimètre Qubit et à l’aide de mesures A 260 sur le spectrophotomètre NanoDrop ND-1000. La limite de détection de l’instrument NanoDrop est de 1,5 μg/ml ; les résultats de concentration de siRNA inférieurs sont présentés à des fins de comparaison. L’exactitude pour le dosage de microARN Qubit était à moins de 15 % de la valeur attendue. Les CV (1 écart-type/moyenne de 8 points de données) allaient de 0,63 % à 2,9 %. Pour les six expériences, la précision du dosage de microARN Qubit était à moins de 15 % des valeurs attendues et les CV étaient <5 %.

Exactitude et étendue

Précision et étendue des dosages de microARN Qubit. Les concentrations d’échantillons de siRNA pur et de miARN ont été déterminées par densité optique sur un spectrophotomètre PerkinElmer™ à des concentrations produisant un A260 de 0,3–0,6. Les échantillons ont ensuite été dilués et testés avec le dosage de microARN Qubit à quatre concentrations connues différentes. Les résultats montrent une quantification précise de (A) quatre molécules de siRNA monocaténaire différentes et (B) deux siRNA bicaténaires et deux miARN bicaténaires.

Données d’intégrité et de qualité (IQ) de l’ARN

Sélectivité et validité

Sélectivité des réactifs de dosage RNA IQ pour le grand ARN et le petit ARN. Des échantillons tripliqués contenant 100 ng/µl d’ARNr (E. coli) et des quantités variables de siARN (0–50 ng/µl) ont été dosés avec le dosage Qubit RNA IQ sur le fluorimètre Qubit 4. Les graphiques montrent (A) les scores d’unités de fluorescence relative (RFU) et (B) d’IQ pour ces échantillons. Les données montrent que les colorants sont spécifiques aux ARN de grande taille (comme l’ARNr) et de petite taille (comme le siRNA), respectivement, et que les scores d’IQ sont fortement corrélés avec le pourcentage d’ARN de grande taille dans l’échantillon.

Dégradation de l’ARNr par la RNase A dans le temps, mesurée par le dosage Qubit RNA IQ. Des échantillons tripliqués de solutions d’ARNr de 100 ng/µl ont été incubés avec différentes doses de RNase A dans la solution de dosage finale contenant des colorants multiplexés et un tampon de dosage. (A) Des doses plus élevées de RNase A ont provoqué une dégradation plus rapide de l’ARN pendant 60 minutes, comme en témoigne son score d’IQ ARN. (B) L’exposition à la RNase A à 10 fM a provoqué une diminution progressive de la fluorescence du grand ARN au cours de l’heure et une augmentation correspondante de la fluorescence du petit ARN. (C) Avec une exposition à la RNase A à 100 fM, les changements se sont produits plus rapidement.

Validation par RT-qPCR

Le dosage IQ ARN est compatible avec les résultats de RT-qPCR, contrairement au nombre d’intégrité d’ARN (RIN) Bioanalyzer™. L’ARN total (isolé du foie humain) a été traité à la chaleur à 75 °C pour des durées variables et analysé à l’aide du système Agilent™ Bioanalyzer™ et du dosage Qubit RNA IQ. L’analyse RT-qPCR a également été effectuée à l’aide des dosages RETROScript de transcriptase inverse et TaqMan hHIF1α et hGAPDH. (A) Les données du système Bioanalyzer montrent une diminution rapide des pics d’ARNr au fil du temps, suggérant une détérioration de l’intégrité de l’ARN. (B) La comparaison des RIN (points noirs) et de l’IQ ARN (triangles gris), y compris des résultats plus détaillés au point de temps de 40 min, montre un désaccord, le RIN diminuant rapidement tandis que l’IQ ARN est largement stable dans le temps. (C) Les résultats de la RT-qPCR ont également été stables dans le temps, en accord avec le dosage IQ ARN mais pas RIN.

Données de quantification des protéines

Exactitude et précision

Détermination précise de la charge protéique à partir de mélanges protéiques complexes. Le dosage Qubit Protein BR et un dosage de Bradford standard ont été utilisés pour déterminer la concentration protéique des lysats de plusieurs types de cellules de mammifères : 293T, A549, HepG2, HeLa et IPSC. Les lysats ont été séparés sur un minigel de protéines Bis-Tris Invitrogen NuPAGE 4–12 % et marqués avec le réactif d’étiquetage des protéines No-Stain. (A) L’image sur gel a été acquise sur le iBright FL 1500 Imaging System et (B) les facteurs de normalisation ont été déterminés à l’aide du logiciel d’analyse Invitrogen iBright. Le coefficient de variation (CV) du dosage de protéine BR Qubit était sensiblement inférieur à celui du dosage de Bradford.

Données de détection des endotoxines

Haute sensibilité et large gamme

  Volume d’entrée d’échantillons          Dilution d’eau sans endotoxine        Plage dynamique  
5 µl 45 µl 1,0 à 10 UE/ml
25 µl 25 µl 0,02 à 2 UE/ml
50 µl 0 µl 0,01 à 1 UE/ml


Le dosage de détection des endotoxines Qubit utilise un flux de travail rationalisé à une seule étape d’incubation et offre une large plage de détection de 0,01 à 1,0 UE/ml en utilisant 50 µl d’échantillon. Le dosage peut détecter avec précision jusqu’à 10,0 UE/ml en utilisant différentes entrées d’échantillons.  Il vous suffit de sélectionner l’icône « Endotoxin » (Endotoxine) sur la page d’accueil du fluorimètre Qubit Flex. Utilisez l’étalon endotoxine fourni pour générer une courbe d’étalonnage en 4 points et mesurer jusqu’à 8 échantillons à la fois à l’aide des barrettes de tubes de dosage apyrogènes Qubit Flex (Réf. de cat. Q32893).

Calculs automatiques

Concentration attendue (UE/ml) 0,010 0,050 0,100 1,00

1,00

5,00

10,00
Concentration moyenne mesurée (UE/ml)

0,0098

0,045

0,099

0,98

0,97

4,96

10,0
CV

5%

2%

8%

5%

4%

6%

10%
Erreur relative

2%

11%

1%

2%

3%

1%

0%


Lorsqu’il est associé au fluorimètre Qubit Flex (Réf. de catalogue Q33327), les calculs sont effectués automatiquement, ce qui réduit le risque d’erreur. Le fluorimètre Qubit Flex calcule automatiquement le coefficient de corrélation à l’aide d’une régression linéaire avec transformation logarithmique telle que décrite par la Pharmacopée des États-Unis. Ensuite, les données de Qubit Flex sont analysées à l’aide de données transformées en logarithme et d’un ajustement quadratique corrigé en fonction de l’arrière-plan. En utilisant l’instrument Qubit Flex, les échantillons de 5 µl et 50 µl ont généré des résultats précis et reproductibles. Les échantillons de 5 µl (en gris) présentaient un CV moyen de <7 % et une erreur relative moyenne de <5 %.  Les échantillons de 50 µl présentaient un CV moyen de 5 % et une erreur relative moyenne de <5 %.

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.