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【ELISAやってみた】Capture Antibodyの濃度を変えたらどうなる？

Written by | Published: 01.24.2023

サンドイッチELISAの系を自作で構築する場合には、抗体ペアの選定、検量線用のスタンダードタンパク質の選定、抗体濃度、反応時間、サンプル調製…と数多くの条件検討が必要です。
ステップ数も多いので、何をどう条件検討すればよいか悩む方も少なくありません。

そこで今回はCapture Antibody（捕捉抗体）にフォーカスし、抗体濃度を変更すると結果がどう変化するかを確認してみました。

▼こんな方におすすめです！
・これから自作ELISAを構築したい
・ELISAの条件検討で悩んでいる

材料と方法

材料：
Invitrogen™IL-6 Mouse Uncoated ELISA Kit with Plates （88-7064-88）

方法：
キットに含まれるCapture Antibodyについて、マニュアル推奨の希釈率がx 250のところ濃度が高い方から順にx 62.5、ｘ 125、ｘ 250、ｘ 500、ｘ 1000、ｘ 2000、の6種類の希釈率で調製しました。

キット付属のプロトコルに従い、以下の作業を行いました。
・調製した各濃度のCapture Antibodyでコーティング
・ブロッキングを行い、それぞれにおいて検量線用のスタンダードサンプル（7段階）を反応
・洗浄、その後の反応ステップを実施
Thermo Scientific™ Multiskan SkyHigh Microplate Spectrophotometerで450 nmの吸光度を測定し、Thermo Scientific™ SkanIt™ソフトウエアで解析し、4 parameter logistic curveで検量線を作成しました。

結果

各希釈率における測定値を利用し、作成された検量線は下記になります。
マニュアル推奨のｘ 250と比較し、Capture Antibodyの濃度がより低い場合（ｘ 500、ｘ 1000、ｘ2000）ではあまり大きく吸光度が変わりませんでした。それに対してCapture Antibodyの濃度がより高い場合（x 62.5、ｘ 125）は、吸光度が大幅に落ちるという結果が得られました。
（アッセイ系によっては、結果は変わる可能性があります）

考察

Capture Antibodyの濃度を下げると吸光度が下がると予想していましたが、今回の検討した範囲では大きな影響は見られませんでした。ただx 2000では若干吸光度が落ちているので、さらに低い濃度ではシグナルが落ちていくことが予想されます。

またCapture Antibodyの濃度を上げた場合（x 62.5、x 125）は、吸光度が上がると予想しましたが、思いのほか大幅に低い値が得られました。理由は特定できておりませんが、コーティング時の抗体濃度が高すぎると、プレート上の抗体の密度が高くなりすぎて、抗原との反応に影響を及ぼした可能性が考えられます。

以上の結果より、自作でELISAの実験系を構築する際には広い抗体濃度について条件検討を行うことの重要性が示されました。

まとめ

・Capture Antibodyの濃度が低いと、最終的に得られる吸光度は下がる
・Capture Antibodyの濃度が高すぎると、抗原との反応に影響があり吸光度が下がる可能性がある
・自作でELISA系を構築する際には、広い抗体濃度について条件検討を行うことが重要

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