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PCRやサンガーシーケンス用プライマーのデザインどうしていますか？– Seq It Out＃5

作成者 04.06.2022

PCRやサンガーシーケンスでは、より良いプライマーのデザインがターゲット増幅やその後のシーケンスの成功に欠かせません。プライマーデザイン時に注意すべきことだけでなく、すでにデザイン済みの最適なプライマーがあったらいいな、と思ったことはありませんか？

そこで今回は、プライマーを設計する際のポイントや便利なツールについて説明したビデオをご紹介します。また、ビデオの内容について下記に簡単にまとめてありますので、こちらもぜひご参考になさってください。

▼こんな方におすすめです！
・プライマーをデザインする際のポイントが知りたい
・便利なデザインツールを探している

シーケンス用プライマーデザインのポイント

サンガーシーケンスのワークフローでは、ゲノムDNAをテンプレートに用いる場合はPCRによってターゲット領域を増幅し、次にシーケンス反応を実行する必要がありますが、精製されたプラスミドDNAを用いる場合は、シーケンス反応を実行するだけで済みます。

PCR反応には、増幅する配列の領域を決定する順方向と逆方向の2つのプライマーが必要ですが、シーケンス反応では1本のプライマーのみが反応に使用されるという点でPCR反応とは異なります。つまり、通常、特定のPCRフラグメントに対して、2つのサンガーシーケンス反応が設定されます。1つは順方向のシーケンス用、もう1つは逆方向のシーケンス用です。

プライマーの設計は、基本的なPCR、シーケンスだけでなく、フラグメント解析や、定量分析など、さまざまな実験系に関わる重要なポイントです。

プライマーを設計する際に考慮するポイントがいくつかあります。
・プライマーの長さは18〜22塩基程度でデザインします。
・プライマーのGC含量は50％から55％になるようにします。
・プライマーの3 ‘末端の最後の1塩基もしくは2塩基をGかCにします（GCロック）。
・プライマーの融解温度は、50℃から55℃位になるようにします。
・同一塩基が連続する領域を避けてプライマーをデザインします。
・プライマーの配列内にも4つ以上の連続塩基は避ける必要があります。

無料のPCR、シーケンスプライマー検索ツールのご紹介

プライマーの設計は簡単ではないため、デザインしたプライマーによっては、実験に余計な時間やコストがかかってしまう可能性があります。そこで、もっと簡単な方法をお探しの方へ、サーモフィッシャーサイエンティフィックの検索ツールをご紹介します。Applied Biosystems™ Primer Designerツールは、無料でPCR用または、シーケンス用プライマーを検索できるツールであり、ヒトエクソームとヒトミトコンドリアゲノムをカバーする600,000を超えるプライマーペアが含まれています。サンプルのアンプリコンの長さと対象遺伝子名などを選択して、検索することができます。

キャピラリー電気泳動装置で次世代シーケンサー（NGS）のデータ確認を行う場合、このツールを使用するとワークフローを大幅に簡素化できます。これは、NGSで得られた.vcfファイルをアップロードすることで使用できます。

Ion Torrentシーケンサーを使用している場合は、イオンレポーターからPrimer Designerツールに.vcfファイルをアップロードできるためさらに便利になり、数回クリックするだけで適切なプライマーを見つけることができます。

まとめ

・カスタムでプライマーをデザインする場合、多くの項目を検討する必要があります。
・無料で使えるPrimer Designerツールがあります。

プライマーデザインでお困りの方は、ぜひPrimer Designerツールを検討してみてください

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