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【やってみた】サンガーシーケンス　シーケンス反応サイクルの伸長時間を短縮したら、どのくらい伸長するのか？

Written by | Published: 04.16.2025

キャピラリーシーケンサでDNAの塩基配列を解析するサンガーシーケンスのフローでは、シーケンス反応によってDNAに蛍光標識をする必要があります。このシーケンス反応サイクルの伸長反応時間は、解析したい配列の長さによって変更が可能ですが、マニュアルの推奨は4分です。

この伸長反応時間を、極端に短縮してみたらどうなるのか、実際どの程度伸長するのか、どこまでで解析ができるのかなど、日頃から疑問に思っていたことを試してみました。

伸長反応時間の検討

シーケンス反応試薬キット Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit の　ユーザーガイド（MAN1000355, RevA） P17では、サイクル中の伸長反応時間は4分とされていますが、注記に「短い鎖長には伸長時間の短縮も可能」との記載もあります。今回は分かりやすく伸長時間を以下の3通りで検証してみることにしました。

  • a. 1秒
  • b. 30秒
  • c. 60秒

1秒では全く伸長しないのではないか？
60秒と半分の30秒では、伸長する長さも半分となるのか？
といった予想を立ててみましたが、果たして結果はどうなるのでしょうか！

シーケンス反応

今回、反応に使用するテンプレート、シーケンスプライマーはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitに同梱されている以下を使用しました。

【反応組成（1 well 当たり）】
試薬 濃度 容量
BigDye Terminator v3.1
ready reaction mix		 ×2.5 4 µL
Sequencing Buffer ×5 2 µL
コントロールDNA
pREF BDT Control DNA		 200 ng/µL 1 µL
プライマー
-21 M13 forward primer		 0.8 mol/µL 4 µL
Nuclease Free Water 9 µL
計 20 µL
【反応条件】伸長反応ステップを、a. 1秒, b. 30秒, c. 60秒の3通りで検証しました
Incubate 25 cycles Hold
熱変性 アニール 伸長
温度 96℃ 96℃ 50℃ 60℃ 4℃
時間 1分 10秒 5秒 a. 1秒
b. 30秒
c. 60秒

使用機種：Applied Biosystems™ ProFlex™ PCR System
ちょうど3通りの条件検討ということで、Applied Biosystems™ ProFlex™ 3×32-wellブロックを使用し、各ブロックにそれぞれa~cの条件を設定して、同時に反応をスタートさせました。1度に別条件が可能となるため、あっという間に反応工程が終了しました。
反応のトータル時間：

  • a.伸長反応1秒：24分
  • b.伸長反応30秒：36分
  • c.伸長反応60秒：48分
図1. ProFlex PCR System, 3×32-wellブロックを使用してのシーケンス反応

図1. ProFlex PCR System, 3×32-wellブロックを使用してのシーケンス反応

反応後の精製

シーケンス反応後は、Applied Biosystems™ BigDye XTerminator™ Purification Kit（BDX）使用し精製を行いました。

【反応組成（1 well 当たり）】
試薬 容量
BigDye XTerminator 20 µL
SAM solution 90 µL
シーケンス反応済サンプル 20 µL
計 130 µL

【撹拌】
2000 rpm、30分

ジェネティックアナライザでの泳動

Applied Biosystems™ SeqStudio™ Flexジェネティックアナライザを使用し、泳動を行いました。

図2. SeqStudio Flexシリーズジェネティックアナライザ

図2. SeqStudio Flexシリーズジェネティックアナライザ

各条件で伸長した長さを比較するため、デフォルト条件の中で最長（125分）かつ、BDX精製サンプル専用のランモジュールを使用し泳動しました。

  • 使用機種：SeqStudio 24 Flex ジェネティックアナライザ
  • ランモジュール：BDxStdSeq50_POP7xl

SeqStudio Flexジェネティックアナライザは、タッチパネルが搭載されており、ランの最中にも、検出されたピークをリアルタイムで確認することができます。ラン終了時も、タッチパネルで波形データをすぐに確認することができ、必要であればそのまま再ランも可能です。

図3. SeqStudio Flexジェネティックアナライザのモニター画面の波形表示例

図3. SeqStudio Flexジェネティックアナライザのモニター画面の波形表示例

関連ブログ記事：柔軟性が向上！？　新型キャピラリーシーケンサ SeqStudio Flexジェネティックアナライザとは？

結果

Applied Biosystems™ Sequencing Analysisソフトウエアを使用し、Rawデータ、波形データの確認を行いました。BDxStdSeq50_POP7xl（125分）にて泳動したRawデータがこちらです。

図4. Rawデータ　上段：a.伸長反応 1秒, 中段：b.伸長反応 30秒, 下段：c.伸長反応 60秒

ジェネティックアナライザでは、泳動された蛍光標識DNA断片を、短いものから順に検出します。その結果得られるRawデータは、長いDNA断片ほど、波形後半にピークが検出されます。1秒の伸長反応時間でも、伸長反応が起こっており、当初の予想を超えた結果となりました。30秒、60秒と伸長反応時間が長くなるにつれ、後半の蛍光強度も高くなっていることが分かります。
また参考までとなりますが、以下、各伸長時間での波形データです。

（画像をクリックでデータ全体を表示）

図5. 伸長反応時間 a.1秒 波形データ

図5. 伸長反応時間 a.1秒 波形データ

図6. 伸長反応時間 b.30秒 波形データ

図6. 伸長反応時間 b.30秒 波形データ

図7. 伸長反応時間c.60秒 波形データ

図7. 伸長反応時間c.60秒 波形データ

上記波形データのClear Rangeは、以下の結果となりました。

表1. Clear Range
Clear Range_Start Clear Range_Stop
a.伸長反応1秒 13 731
b.伸長反応30秒 11 875
c.伸長反応60秒 13 941

Clear Range：5′末端と3′末端の両方で低品質またはエラーになりやすい配列を除外した後に残る配列の領域です。ElectropherogramとSequenceビューでは、除外されたデータはグレーで表示されます。
今回は、SeqStudioFlex一次解析デフォルト設定にて、Clear Rangeの解析を行いました。

図8. SeqStudio Flexジェネティックアナライザ 一次解析Clear Range設定内容

図8. SeqStudio Flexジェネティックアナライザ 一次解析Clear Range設定内容

まとめ

いかがでしたでしょうか。伸長時間が1秒であっても、今回採用した解析条件では、700 bp程度まで精度高く解析できていることに驚きました。これは、プライマーのアニーリングステップ（50℃、5秒）で、アニーリングと同時に伸長反応が進行しており、計6秒の伸長時間によるものではないかと考えられます。また、伸長反応時間を延長することで、高分子側の蛍光強度の増加が観察されました。この結果からも分かるように、長い鎖長の配列解析を行う際には、伸長時間を推奨の4分に設定し、高分子側まで十分に伸長させ、蛍光強度を高めることが、解析の精度向上につながります。

今回は、キット付属のコントロールDNAをテンプレートとして使用しましたが、実際のサンプルの場合、配列や反応効率の違いの影響も考えられるため、十分な検証が必要です。

サンガーシーケンシング　ハンドブック

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