Superior cDNA synthesis with SuperScript IV Reverse Transcriptase

具有卓越cDNA合成性能的SuperScript IV 逆转录酶

在许多cDNA合成应用中,Invitrogen SuperScript系列逆转录酶(RTs)都是使用范围最广、引用度最高的RTs。最新面市的Invitrogen Superscript IV RT,可提供出色的cDNA合成性能,即使是针对最具挑战的RNA样本。

当有四大理由足以让你爱上SuperScript IV RT时,何必退而求其次:

  • 高效率 - 高达100x的cDNA产量
  • 超灵敏超灵敏 - 使RT-qPCRCt 值减少多达8个循环
  • 超强力 - 甚至可转录来源于降解了的或含有抑制剂的RNA样本
  • 超快速 - 10分钟反应时间

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多种SuperScript IV RT产品形式可供选择。第一链合成系统包括所有cDNA合成所需的反应组分分别放在不同管里,以最大地限度优化反应条件。在预混液中,cDNA合成反应组分预先混合在 RT-qPCR应用中以实现卓越效率,并降低变异性。在一步法中,SuperScript IV RT 结合Platinum SuperFi DNA聚合酶一起实现一步RT-qPCR应用。

  SuperScript IV 逆转录酶 SuperScript IV 第一链合成系统 SuperScript IV VILO 预混液 SuperScript IV 一步法RT-PCR系统
规格 单酶 cDNA合成试剂盒 用于两步法RT-PCR的cDNA合成反应预混液 RT-PCR一步法体系
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SuperScript IV 逆转录酶优点

有效逆转录低丰度或降解的RNA

有效RT,可对最棘手的RNA模板进行反转录,包括低丰度或降解的RNA。SuperScript IV RT非常稳定、高效,与其他市售RTs相比,它可实现将降解RNA转录出的cDNA高出100倍(图1)。SuperScript IV RT为任何类型RNA合成cDNA的最佳选择,是针对降解或低丰度RNA的独特解决方案。

RT-efficiency-superscript
Figure 1. High efficiency with degraded RNA. RT-qPCR of degraded RNA (RIN 1–3) from human cells and plant tissues was performed with different RTs and Applied Biosystems TaqMan Assays. Delta Ct values (ΔCt = Ct – Ct SuperScript IV) show that SuperScript IV RT delivered up to 100x higher cDNA yields and lower Ct values than SuperScript III and other RTs.

增加对挑战RNA样本的灵敏度和重现性

如要确保基于cDNA实验中的稳定性,需保证RTs提供高反应灵敏度和低可变性。例如,在三次RT-qPCR反应中,使用三种不同数量降解RNA与不同的RTs (图2)。结果表明,与其他市售RTs相比,SuperScript IV RT的Ct 值(减少了8个循环)和标准偏差最低。证实SuperScript IV RT可提供更好的反应灵敏度和重现性,以提供高可信度的结果。

Sensitivity and variability of SuperScript IV RT and RTs from other suppliers with degraded plant RNA
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Figure 2. Sensitive and reproducible cDNA synthesis using challenging RNA samples. Degraded Arabidopsis total RNA (RIN: 1–3), in amounts of 1–100 ng, was used in 20 μL SuperScript IV RT reactions with random hexamers according to the product protocol. RTs from other vendors were used according to the manufacturers’ recommended protocols. For each RT enzyme, three reverse transcription reactions were performed for each input RNA. From each reverse transcription reaction, 10% of the cDNA product was added to TaqMan Assays for two targets, Gln synthetase and WRKY TF 70. Three qPCR reactions were performed for each reverse transcription reaction and the average Ct values for each RNA input were plotted (standard deviation from 9 Ct values for each input RNA).

在存在抑制剂的情况下进行强力转录

即使采用彻底的纯化方法,许多对RTs有抑制作用的化合物在RNA样本中仍然常见。这些化合物会干扰cDNA合成,导致错误的RT-PCR和RT-qPCR结果,并对实验体系造成误差。RT抑制剂包括在RNA提取过程中使用的试剂,以及生物样本中产生的共纯化污染物 (表1)。

与Invitrogen SuperScript III和其他市售RTs(图3)相比,SuperScript IV RT对污染抑制剂的抵抗能力明显提高。

表 1. 常见cDNA合成抑制剂及其来源

抑制剂 来源
乙醇/异丙醇盐、酚/氯仿,清洗剂 样本制备
肝素、血色素、胆汁盐 血液、粪便
腐殖酸、多酚、多糖 土壤、植物
福尔马林、石蜡 FFPE
Resistance to inhibitors
Figure 3. Higher performance in cDNA synthesis in the presence of biological or sample prep inhibitors. A 0.5–10 kb RNA ladder was used in a 10 μL SuperScript IV RT reaction with oligo(dT)20 according to the product protocol. RTs from other vendors were used according to their respective recommended protocols. Inhibitors were added to the RNA samples prior to primer annealing or addition of RT reaction mix. First-strand cDNAs were resolved by alkaline gel electrophoresis, and cDNA was stained using Invitrogen SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain. During electrophoresis NaOH hydrolyzes all RNA, resulting in visualization of cDNA only.

cDNA合成仅需10分钟

SuperScript IV RT是一种快速合成酶,它可快速进行cDNA合成,生成长且完整的cDNA片段。图 4 表明,10分钟内, SuperScript IV RT合成的cDNAs长达9 kb,而大多数其他市售RTs在相同的时间内,只能合成1.5-3 kb或更少的cDNAs。

Fast cDNA synthesis capability

 

快速cDNA合成能力根据产品操作流程, InvitrogenMillennium RNA 标准品用于10 μL SuperScript IV RT与寡核苷酸(dT)的反应。根据他们各自推荐方案使用各自的RTs,除了反应时间减少到10分钟。用碱性凝胶电泳法分离第一链的cDNA,并用SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain对cDNA染色。在电泳过程中,NaOH水解了全部RNA,导致仅仅可以看见cDNA。

可信赖的高级结构模板转录

RNA二级结构,特别是富含GC的模板,在反应温度低(低于42℃ )的情况下会干扰cDNA合成。SuperScript IV RT具有高热稳定性,可用于50℃或更高温度的反应,有助于确保即使是高级结构RNA模板的成功转录 (图 5)。

High thermostability of SuperScript IV RT

图 5. SuperScript IV RT热稳定性高。 根据产品操作流程,0.5–10 kb RNA标准品用于10 μL SuperScript IV RT与寡核苷酸(dT)的反应,而在50-65℃ 之间确立不同的反应温度。由碱性凝胶电泳法分离第一链的cDNAs,用SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain对cDNA染色。在电泳过程中,NaOH水解了全部RNA,导致仅仅可以看见cDNA。对每个反应温度下cDNA条带的量化分析由 TotalLab软件进行。SuperScript IV RT活性百分比为其在每个反应温度条件下的活性值与50℃条件下活性值的比值。

有效逆转录低丰度或降解的RNA

有效RT,可对最棘手的RNA模板进行反转录,包括低丰度或降解的RNA。SuperScript IV RT非常稳定、高效,与其他市售RTs相比,它可实现将降解RNA转录出的cDNA高出100倍(图1)。SuperScript IV RT为任何类型RNA合成cDNA的最佳选择,是针对降解或低丰度RNA的独特解决方案。

RT-efficiency-superscript
Figure 1. High efficiency with degraded RNA. RT-qPCR of degraded RNA (RIN 1–3) from human cells and plant tissues was performed with different RTs and Applied Biosystems TaqMan Assays. Delta Ct values (ΔCt = Ct – Ct SuperScript IV) show that SuperScript IV RT delivered up to 100x higher cDNA yields and lower Ct values than SuperScript III and other RTs.

增加对挑战RNA样本的灵敏度和重现性

如要确保基于cDNA实验中的稳定性,需保证RTs提供高反应灵敏度和低可变性。例如,在三次RT-qPCR反应中,使用三种不同数量降解RNA与不同的RTs (图2)。结果表明,与其他市售RTs相比,SuperScript IV RT的Ct 值(减少了8个循环)和标准偏差最低。证实SuperScript IV RT可提供更好的反应灵敏度和重现性,以提供高可信度的结果。

Sensitivity and variability of SuperScript IV RT and RTs from other suppliers with degraded plant RNA
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Figure 2. Sensitive and reproducible cDNA synthesis using challenging RNA samples. Degraded Arabidopsis total RNA (RIN: 1–3), in amounts of 1–100 ng, was used in 20 μL SuperScript IV RT reactions with random hexamers according to the product protocol. RTs from other vendors were used according to the manufacturers’ recommended protocols. For each RT enzyme, three reverse transcription reactions were performed for each input RNA. From each reverse transcription reaction, 10% of the cDNA product was added to TaqMan Assays for two targets, Gln synthetase and WRKY TF 70. Three qPCR reactions were performed for each reverse transcription reaction and the average Ct values for each RNA input were plotted (standard deviation from 9 Ct values for each input RNA).

在存在抑制剂的情况下进行强力转录

即使采用彻底的纯化方法,许多对RTs有抑制作用的化合物在RNA样本中仍然常见。这些化合物会干扰cDNA合成,导致错误的RT-PCR和RT-qPCR结果,并对实验体系造成误差。RT抑制剂包括在RNA提取过程中使用的试剂,以及生物样本中产生的共纯化污染物 (表1)。

与Invitrogen SuperScript III和其他市售RTs(图3)相比,SuperScript IV RT对污染抑制剂的抵抗能力明显提高。

表 1. 常见cDNA合成抑制剂及其来源

抑制剂 来源
乙醇/异丙醇盐、酚/氯仿,清洗剂 样本制备
肝素、血色素、胆汁盐 血液、粪便
腐殖酸、多酚、多糖 土壤、植物
福尔马林、石蜡 FFPE
Resistance to inhibitors
Figure 3. Higher performance in cDNA synthesis in the presence of biological or sample prep inhibitors. A 0.5–10 kb RNA ladder was used in a 10 μL SuperScript IV RT reaction with oligo(dT)20 according to the product protocol. RTs from other vendors were used according to their respective recommended protocols. Inhibitors were added to the RNA samples prior to primer annealing or addition of RT reaction mix. First-strand cDNAs were resolved by alkaline gel electrophoresis, and cDNA was stained using Invitrogen SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain. During electrophoresis NaOH hydrolyzes all RNA, resulting in visualization of cDNA only.

cDNA合成仅需10分钟

SuperScript IV RT是一种快速合成酶,它可快速进行cDNA合成,生成长且完整的cDNA片段。图 4 表明,10分钟内, SuperScript IV RT合成的cDNAs长达9 kb,而大多数其他市售RTs在相同的时间内,只能合成1.5-3 kb或更少的cDNAs。

Fast cDNA synthesis capability

 

快速cDNA合成能力根据产品操作流程, InvitrogenMillennium RNA 标准品用于10 μL SuperScript IV RT与寡核苷酸(dT)的反应。根据他们各自推荐方案使用各自的RTs,除了反应时间减少到10分钟。用碱性凝胶电泳法分离第一链的cDNA,并用SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain对cDNA染色。在电泳过程中,NaOH水解了全部RNA,导致仅仅可以看见cDNA。

可信赖的高级结构模板转录

RNA二级结构,特别是富含GC的模板,在反应温度低(低于42℃ )的情况下会干扰cDNA合成。SuperScript IV RT具有高热稳定性,可用于50℃或更高温度的反应,有助于确保即使是高级结构RNA模板的成功转录 (图 5)。

High thermostability of SuperScript IV RT

图 5. SuperScript IV RT热稳定性高。 根据产品操作流程,0.5–10 kb RNA标准品用于10 μL SuperScript IV RT与寡核苷酸(dT)的反应,而在50-65℃ 之间确立不同的反应温度。由碱性凝胶电泳法分离第一链的cDNAs,用SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain对cDNA染色。在电泳过程中,NaOH水解了全部RNA,导致仅仅可以看见cDNA。对每个反应温度下cDNA条带的量化分析由 TotalLab软件进行。SuperScript IV RT活性百分比为其在每个反应温度条件下的活性值与50℃条件下活性值的比值。