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Guide RNAs für CRISPR-Cas9 |
Hochwertige gRNAs für CRISPR-Cas9 und Screeninganwendungen
Wenn Sie das CRISPR-Cas9-System verwenden, um die Genexpression auszuschalten oder eine bestimmte Mutation einzuschleusen, sind das Design, die Produktion und die Übertragung von qualitativ hochwertigen guide RNAs (gRNAs) entscheidend für den Erfolg. Ganz gleich, ob Sie transfektionsfertige gRNAs für die Verwendung mit TrueCut Cas9-Proteinen benötigen oder ob Sie Lentiviren einsetzen möchten, um Ihre Editierwerkzeuge in schwer zu transfizierende oder Primärzellen einzuschleusen, wir haben was Sie brauchen. Verwenden Sie unsere gRNA-Gen-Suchfunktion, um vorgefertigte gRNAs in einem dieser Formate zu finden, oder gehen Sie zu unserer Auswahlhilfe unten, um weitere Optionen zu erhalten.
Für das funktionelle Genomscreening haben wir unsere fortschrittlichen gRNA-Designs auch in CRISPR-Bibliotheken für das Array-Screening im Hochdurchsatzverfahren oder kostengünstige gepoolte Screenings verpackt.
Wählen Sie aus verschiedenen CRISPR-gRNA-Formaten
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Erfahren Sie mehr über TrueGuide Synthetische gRNAs
Erfahren Sie mehr über LentiArray CRISPR-gRNAs
Erfahren Sie mehr über IVT-gRNAs
Auswahlhilfe für CRISPR gRNA-Formate
 TrueGuide Synthetische gRNA |  LentiArray lentivirale gRNA |  Precision gRNA Synthese-Kit | |
| Überblick |
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| Format | Synthetisches RNA-Oligo, chemisch modifiziert für Stabilität | Lentivirale Partikel | In-vitro-transkribierte (IVT) gRNA |
| Anwendung | Knockout (vorgefertigt) oder Knock-in (benutzerdefiniert) | Knockout, einschließlich Bibliotheksscreening | Knockout oder Knock-in |
| Spezies |
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| Übertragungsmethode | Lipidvermittelte Transfektion oder Elektroporation | Lentivirale Transduktion | Lipidvermittelte Transfektion oder Elektroporation |
| Empfohlenes Cas9-Format | TrueCut Cas9-Proteine | LentiArray Cas9-Lentivirus | TrueCut Cas9-Proteine |
| Kontrollen | Positiv- und Negativkontrollen verfügbar | Positiv- und Negativkontrollen verfügbar | |
| Jetzt bestellen | Jetzt bestellen | Jetzt bestellen |
Quick-Tools für die Suche und Bestellung von gRNAs
Suchen Sie nach vorgefertigten synthetischen oder lentiviralen CRISPR-sgRNAs
TrueGuide Synthetische gRNAs sind transfektionsfertige CRISPR-Single-Guide-RNAs (sgRNAs), die speziell für das präzise und hocheffiziente Knockout Ihres Zielgens entwickelt wurden. Wenn Sie editierte Zellen anreichern müssen, mit schwer zu transfizierenden Zellen arbeiten oder eine langfristige sgRNA-Expression benötigen, verwenden Sie unsere LentiArray CRISPR-gRNAs.
Finden Sie vorgefertigte TrueGuide gRNAs mit unserer Gen-Suchfunktion
Finden Sie vorgefertigte LentiArray CRISPR-gRNAs mit unserer Auswahlhilfe
Bestellen Sie eine individuelle synthetische gRNA
Sie haben ein eigenes Design? Ob aus einer Fachzeitschrift, von einem Kollegen oder aus Ihrem bevorzugten Design-Tool – nutzen Sie unsere einfache und schnelle Benutzeroberfläche, um die individuellen gRNA-Sequenzen hochzuladen, die Sie zu einer benutzerdefinierten TrueGuide gRNA synthetisieren lassen möchten.
Verwenden Sie unser Design-Tool, um ein Geneditierungsexperiment zu erstellen und Ihre gRNAs zu bestellen
Sie brauchen Unterstützung bei der Entwicklung einer gentechnisch veränderten Zelllinie? Mit unserem kostenlosen TrueDesign Genome Editor können Sie Ihr CRISPR-Gen-Knockout-, Knock-in oder Tagging-Experiment entwerfen und einen kompletten Satz an Reagenzien (einschließlich gRNAs) dafür bestellen.
Entwerfen und bestellen Sie Reagenzien für Ihr gesamtes CRISPR-Edit mit dem TrueDesign Genome Editor
Für Guide-RNAs im Plattenformat oder andere Sonderbestellungen nehmen Sie bitte Kontakt mit uns auf.
Wenn Sie mehr als 24 gRNAs für die Lieferung auf einer 96-Well-Platte oder gRNAs für die Verwendung mit anderen Nukleasen oder spezifischen Scaffold-Sequenzen bestellen möchten, kontaktieren Sie uns bitte unter GEMservices@thermofisher.com.
TrueGuide Synthetische gRNA für CRISPR
Invitrogen TrueGuide Synthetische gRNAs sind transfektionsfertige CRISPR-Guide-RNAs, die mithilfe eines propietären Algorithmus für hocheffiziente Editierung entwickelt wurden. Diese vorgefertigten, garantierten Single-Guide-RNAs bieten einen gezielten Knockdown mit hoher Spezifität in den Genomen von Mensch und Maus.
TrueGuide einteilige modifizierte synthetische gRNA | |
| Vorgefertigte Knockouts für Mauszellen und menschliche Zellen | |
| Benutzerdefinierte Sequenzen | |
| Validierte Kontrollen verfügbar | |
| Im Plattenformat erhältlich | |
| Bereit zur Transfektion | |
| Chemische Modifikationen* | |
| Ideal für Primär- und Stammzellen |
* Die chemischen Modifikationen umfassen 2'O-Methyl-Analoga und Phosphorothioat-Verbindungen zur Steigerung der Editiereffizienz und zum Schutz vor Nukleaseabbau.
Daten: Hocheffiziente Editierung mit TrueGuide Synthetischen gRNAs
Abbildung 1. Robuste Spaltung von Kinase-Genen mit TrueGuide Synthetischen gRNAs in Cas9-exprimierenden ME-180 Zellen Die durchschnittliche Spaltungseffizienz betrug >60 %.
Daten: TrueGuide Synthetische gRNAs tragen zur Erhaltung der Zellviabilität bei.
Abbildung 2. TrueGuide Synthetische gRNAs, die nach optimierten Protokollen eingebracht werden, verursachen minimale Zelltoxizität. Lipofectamine CRISPRMAX wurde verwendet, um TrueCut Cas9 Protein v2 und zielspezifische TrueGuide Synthetische gRNAs mithilfe unserer empfohlenen Transfektionsprotokollein zwei Krebszelllinien zu komplexieren und einzubringen. Von den drei Loci waren zwei (PRKCG-T1 und CMPK1-T1) als schwierig zu editieren bekannt. Die Zellviabilität wurde mit PrestoBlue gemessen. Die Daten ergaben, dass die Transfektion nur minimale Toxizität verursachte, wobei die Zellviabilität insgesamt bei nahezu 100 % lag.
TrueGuide Synthetische Guide RNAs – Häufig gestellte Fragen (FAQs)
Die gRNA, auch Guide-RNA genannt, ist Teil des CRISPR-Cas9-Systems. Das gRNA-Molekül besteht aus zwei Komponenten: Einer zielspezifischen CRISPR-RNA (crRNA) und einer zusätzlichen trans-aktivierenden crRNA (tracrRNA). Die gRNA lenkt das Cas9-Protein durch Basenpaarung zwischen der 20-mer crRNA-Sequenz und der genomischen Zielsequenz zu einem bestimmten genomischen Locus.
sgRNA steht für Single Guide RNA, im Gegensatz zum herkömmlichen, nativen S. pyogenes CRISPR-Cas9-System, das einen zweiteiligen Guide verwendet, in dem CRISPR-RNA (crRNA) mit einer tracrRNA hybridisiert wird. Eine sgRNA kombiniert beide RNAs zu einer einzigen, langen RNA. sgRNAs sind in der Regel 100 nt lang und können aus einem Vektor exprimiert oder chemisch synthetisiert werden.
Da die modifizierte sgRNA über mehr Zelltypen hinweg eine überlegene Effizienz aufweist als das zweiteilige System, wurde das TrueGuide-crRNA:tracrRNA-two-part-guide-RNA-Produktformat eingestellt. Dies hat es uns ermöglicht, unser Angebot an synthetischer gRNA zu vereinfachen und uns auf die modifizierte sgRNA zu konzentrieren.
CRISPR-gRNAs sind bei Thermo Fisher Scientific als chemisch synthetisierte RNA-Oligos, verpackte lentivirale Partikel oder als in vitro-transkribierte (IVT) gRNAs mit dem GeneArt Precision gRNA Synthesekit erhältlich.
Zu den chemischen Modifikationen gehören 2' O-Methyl-Analoga und Phosphorothioat-Internucleotid-Verbindungen an den 5' und 3' Enden des Moleküls. Diese Modifikationen erhöhen die Editiereffizienz, indem sie die Bindung an den Zielstandort erhöhen bzw. den Nukleaseabbau hemmen.
Mit dem benutzerdefinierten gRNA-Bestelltoolkönnen Sie eine sgRNA ohne chemische Modifikationen erwerben.
TrueGuide Synthetische gRNA bietet bei der Transfektion mit TrueCut Cas9-Protein eine maximale Editiereffizienz über viele Zelltypen hinweg und minimiert gleichzeitig die Zelltoxizität und die angeborenen Immunreaktionen. Im Gegensatz zu einem plasmidbasierten System ist das RNP-System transient und hat einen schnelleren Turnover, wodurch zufällige Integrationen und Off-Target-Effekte minimiert werden.
TrueGuide Synthetische gRNA-Sequenzen werden mittels Massenspektrometrie analysiert, um die Sequenzintegrität zu überprüfen.
Um die Effizienz der CRISPR/Cas9-basierten Editierung in einer gepoolten Zellpopulation zu schätzen, können das GeneArt Genom-Spaltungsnachweiskit, Next-Generation Sequenzierung (NGS) oder die Sanger-Sequenzierung verwendet werden. Beide Sequenzierungsmethoden – NGS der Amplikons aus editierten Populationen oder Sanger-Sequenzierung von in Plasmide klonierten Amplikons – liefern eine genauere Schätzung der prozentualen Editiereffizienz und der Indel-Typen. Auf der Seite TALEN- and CRISPR-Validierunswerkzeuge finden Sie eine ausführliche Beschreibung dieser Methoden, und im Benutzerhandbuch zu TrueGuide Synthetischer gRNA finden Sie Einzelheiten zum Protokoll.
LentiArray lentivirale gRNA für das Screening und die Editierung schwer zu transfizierender Zelllinien
Invitrogen LentiArray CRISPR-gRNA sind vorgefertigte, vorverpackte gRNA-Lentiviren, die für ein effizientes Gen-Knockout entwickelt wurden. LentiArray CRISPR-gRNA-Designs wurden mit einem propietären gRNA-Designalgorithmus entwickelt und sind für maximale Knockout-Effizienz ohne Beeinträchtigung der Spezifität optimiert.
LentiArray CRISPR-gRNAs sind verfügbar, um die Assayentwicklung vor dem Screening und die Treffervalidierung nach dem Screening zu unterstützen, wenn Sie Hochdurchsatz-Screening-Experimente mit den LentiArray CRISPR-Bibliotheken durchführen. LentiArray CRISPR-gRNA sollte zusammen mit LentiArray Cas9-Lentivirus verwendet werden, um Genomeditierungsexperimente in schwer zu transfizierenden Zelllinien und Primärzellen durchzuführen.
Daten: Erfolgreicher Knockout von EGFP mit LentiArray gRNA
Abbildung 3. CRISPR-Cas9-vermittelter Knockout von EGFP mit LentiArray gRNA(A) A431-Zellen wurden mithilfe von LentiArray Cas9-Lentivirus und LentiArray CRISPR-gRNA einem EGFR-Knockout (rechte Spalte) unterzogen und mit unbehandelten Zellen (Wildtyp, linke Spalte) sowie mit Cas9, aber nicht mit gRNA behandelten Zellen (Cas9-Kontrolle, mittlere Spalte) verglichen. Die Zellen wurden auf EGFR-Expression (grün), Zellkerne (blau) und Zytoskelett-F-Aktin (rot) angefärbt und auf Immunfluoreszenz analysiert. Ein Verlust der EGFR-Expression wurde nur in EGFR-Knockout-Zellen (c, f) beobachtet. (B) Eine Verringerung des EGFR-Signals wurde auch im Western Blot für das Zielprotein in EGFR-Knockout-Zellen beobachtet, im Gegensatz zu den Kontrollen.
IVT-gRNA für die schnelle Generierung von benutzerdefinierten Designs
Das GeneArt Precision gRNA Synthesekit ist ein umfassendes System für die schnelle Synthese von guide RNA (gRNA).
Bei diesem Kit dienen zwei kurze Einzelstrang-Oligos, die für die Zielsequenz kodieren, als Ausgangsmaterial, und das gRNA-Template wird aus diesen Oligos mit einem T7-Promotor in einer kurzen „one-pot“-PCR-Reaktion zusammengesetzt. Anschließend wird das assemblierte Produkt als Matrize in einer in vitro-Transkriptionsreaktion (IVT) verwendet. Ein anschließender schneller Aufreinigungsschritt erzeugt in nur vier Stunden transfektionsfertige gRNA in hoher Ausbeute (>10 µg) und hoher Konzentration (>200 ng/µl).
Die Kombination von IVT-gRNA mit unserem TrueCut Cas9-Protein v2 wurde in einer Vielzahl von Suspensions- und adhärenten Zelllinien mit einer Spaltungseffizienz von > 70 % und ohne Anzeichen von Toxizität getestet.
Die daraus resultierende gRNA kann auch mit unserer transfektionsfertigen CRISPR-Nuklease-mRNA co-transfiziert werden. Sowohl das Protein- als auch das mRNA-Cas9-Format erfordern keine Plasmidmanipulation und sind mit Hochdurchsatz- und Multiplex-Genom-weitem Zellengineering-Ansätzen kompatibel.
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