多模式酶标仪中的5种检测方法

A scientist in PPE inserts a 96 well plate into a multimode microplate reader

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什么是微孔板读数仪？

微孔板检测仪或称为板式检测仪，是一种实验室仪器，用于检测装在微孔板（也称为微井板）中的样品发生的生物、化学或物理事件。这些设备对于研究、高通量筛选、诊断以及药物发现至关重要。

微孔板读数仪通过多种检测方法分析样品，包括：

吸光度，测量样品在特定波长下吸收了多少光。
荧光，检测荧光分子发射的光。
化学发光，测量化学反应产生的光。
时间分辨荧光（TRF），用于敏感应用的增强型荧光检测。
荧光偏振（FP）用于结合研究。
荧光共振能量转移（FRET），检测两个荧光分子之间的能量转移，常用于分子相互作用研究。
AlphaScreen/AlphaLISA用于生化分析。

微孔板检测仪可能提供一种或多种检测模式。微孔板检测仪主要有两种类型：

单模式检测仪(专门针对一种检测方法)
多模式检测仪(能够进行多种检测方法，使其更具灵活性) versatile)

现代微孔板读数仪通常与自动化系统集成，用于高通量筛选和实时数据分析，使其成为先进研究应用中不可或缺的工具。它们还可能采用不同的光学机制进行分析。

微孔板读数仪在药物发现（如潜在药物的高通量筛选）、分子生物学（如DNA、RNA和蛋白质定量）、食品安全与环境监测（如检测污染物或毒素）等众多研究领域都非常有用。

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微孔板读数仪常见的检测模式有哪些？

1. 光度法：吸光度和浊度测定

光度测量使用微孔板检测仪基于光子的光可以被溶液中的样品吸收或散射这一原理。对光吸收的测量用于基于吸光度的微孔板分析，而对光散射的测量则用于浊度法微孔板分析。吸光度和浊度测量既经济实惠又操作简便，适用于各种稳健的微孔板检测。

微孔板读数仪中的吸光度检测用于测量样品吸收的光量。当光通过样品时，部分光被样品中的分子吸收，从而减少到达检测器的光强度。由于分子在特定波长下吸收光，因此可以根据吸收的光量进行定量。可见吸光度检测利用染料，在反应或分子活动后产生颜色，并可通过溶液染料变深时吸光度变化进行监测。紫外吸光度检测无需外部染料，基于对样品内在吸光度的测量。基于吸光度的微孔板读数仪常见应用包括：

核酸和蛋白质 260/280 nm处的定量分析
比色法蛋白质定量分析（如BCA蛋白质分析法和Bradford蛋白质分析法)
酶联免疫吸附测定（ELISAs)
细胞活力检测，通过在活细胞中产生比色信号（例如，CyQUANT XTT细胞活力检测)

微孔板读数仪中的浊度检测涉及根据悬浮颗粒或溶液的混浊程度来测量光子的散射。样品中颗粒浓度越高，浊度和光散射就越大，从而减少照明时到达检测器的光量。导致光散射的颗粒可以包括细胞、聚集体、沉淀物或溶液中存在的其他固体。细菌生长曲线是采用浊度测量的一种常见应用。

2. 荧光测定法：荧光强度、FRET和荧光偏振

微孔板读数仪可用于荧光检测通过测量荧光团在特定波长激发后发出的光来实现。荧光团能够在某一波长吸收光，然后以更长波长发出荧光，可以与其他分子结合或作为分子活动或反应的指示剂使用。荧光分子具有激发和发射谱，使其能通过微孔板读数仪用其激发谱范围内的灯照明，并随后检测较长波长的发射进行分析。荧光强度与荧光团浓度呈线性关系，可用于定量测量。与吸收法相比，荧光法具有更高灵敏度、更宽动态范围，并能实现多重标记不同荧光团。常见利用荧光强度进行分析的微孔板读数仪应用包括：

使用结合DNA和RNA的荧光染料进行核酸定量Quant-iT DNA和RNA检测试剂)
用活细胞的还原环境将雷扎红转化为荧光罗丹明的细胞活性和增殖检测PrestoBlue和alamarBlue细胞活性检测试剂
钙流检测
荧光报告基因检测(GFP、YFP等)用于测量基因表达和信号通路激活

多模式酶标仪还用于一些特殊的荧光技术，例如荧光共振能量转移（FRET）和荧光偏振。FRET实验基于两种荧光分子：供体和受体。当它们彼此靠近时，能量会从一个分子转移到另一个分子。供体分子吸收激发光后，并不直接发射光，而是将能量转移给受体分子，受体随后在更长波长处发射光。要发生FRET，供体的发射光谱与受体的激发光谱必须有重叠。FRET常用于研究分子间相互作用，以确定两种分子是否结合或彼此接近。荧光偏振是另一种荧光技术，其中荧光团通过偏振光被激发，然后利用其发射出的偏振光来判断分子的取向和流动性。

3. 时间分辨荧光测定法：TRF和TR-FRET

时间分辨荧光（TRF）是一种特殊的荧光技术，它使用具有较长荧光寿命的荧光团，如镧系螯合物或隐窝配合物。这些分子的荧光发射相比标准荧光团来说延迟且持续时间更长，因此可以用短脉冲激发后，在一段时间延迟后再进行信号检测。由于检测是在激发脉冲之后延迟进行，可以显著减少来自标准荧光团的背景和自发荧光，提高信噪比。

TRF是一种对微孔板读数仪非常敏感的检测技术，经常用于药物筛选相关的微孔板实验中。时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）结合了TRF和FRET，通过供体和受体之间的能量转移实现，当供体被激发后，其延迟产生的荧光可被检测到。TR-FRET常用于需要高灵敏度的分子相互作用研究，以及蛋白质翻译后修饰如下所述等方面的检测：LanthaScreen 激酶活性分析。

4. 发光测定法：发光和BRET

微孔板读数仪可用于发光检测其中，光是由化学或生化反应产生的，通常涉及发光底物和酶。具有发光性的化合物在可见波长范围内发射光，不需要外部光源进行激发。发光可以分为化学发光，即通过含有发光分子的化学反应（如鲁米诺）产生的光；或生物发光，即来自于能自然产生荧光生物分子的生物体（如萤火虫中的荧光素酶）的自然发亮现象。

对于微孔板分析来说，发光法具有最高灵敏度和低背景信号。闪烁型发光分析会产生短暂但强烈的瞬时发射，而辉光型发光分析则能持续较长时间、但强度较低且更稳定地释放出可检测信号。基于发光的微孔板分析常用于高通量筛选（HTS）应用，因为其灵敏度高且操作简单。常见的基于发光的微孔板检测应用包括：

基于ATP测定细胞活力的方法，这类方法依赖于ATP作为荧光素酶产生活性的必需成分（如CellTiter-Glo及ATP检测试剂盒)
基于发光法的报告基因分析用于测量基因表达和信号通路激活

生物发光共振能量转移（BRET）是一种与FRET类似的技术，但它涉及从发光供体向荧光受体转移发射的光。

5. Alpha检测技术：AlphaScreen和AlphaLISA

Alpha检测技术是一种基于微孔板读数器的珠粒结合分析方法，利用供体珠和受体珠在接近时产生发光信号。供体珠在680 nm红色激发下产生单态氧，单态氧随后扩散到受体珠，产生520-620 nm范围内的发射，被板读仪检测。可以将分子连接到珠粒上，使供体和受体珠在结合时靠近，从而启动单态氧从供体到受体的转移。在AlphaScreen微孔板分析中使用的受体珠可在520-620 nm范围内发射宽谱光，而AlphaLISA受体珠则具有更窄且更亮的发射谱，使其适用于复杂且富含蛋白质样品（如血清或血浆）的微孔板分析。

在Alpha检测分析中，激发波长高于发射波长，比TRF更有效地消除背景荧光和自发荧光。与TR-FRET和BRET等其他接近性分析相比，Alpha检测分析也更容易设置和设计，无需复杂优化。由于Alpha检测分析为均相，不需要在检测前分离或清洗结合与未结合分子，因此常用于高通量筛选（HTS）及药物发现微孔板读数应用。其他常见应用包括：

蛋白质-蛋白质相互作用研究
生物标志物检测

多模式微孔板检测仪的检测模式比较

检测模式	原理	优势与特点	常见检测方法及应用
吸光度	测量样品吸收的光的数量	•成本效益高 •检测方法稳定可靠	•蛋白质定量 •核酸定量 •细胞活性 •酶联免疫吸附测定（ELISA）
浊度法	测量样品的光散射	•成本效益高 •检测方法稳定可靠	细菌生长曲线
荧光法	测量荧光样品在激发下的发射	•高灵敏度 •宽动态范围 •多重检测	•核酸定量 •细胞活性 •钙流动分析 •报告基因分析（如GFP，YFP）
发光	测量化学或生化反应中产生的光	•最高灵敏度 •不需要激发光	•细胞活性/ATP检测 •报告基因分析 •高通量筛选
时间分辨荧光	测量具有长荧光寿命分子的延迟荧光发射	•高灵敏度 •时间延迟可减少荧光背景	•相互作用研究 •蛋白质翻译后修饰研究 •药物发现
Alpha 检测	当微球靠近时测量光发射	•均相检测 •无需洗涤步骤 •激发波长高于发射波长，可消除荧光背景	•高通量筛选 •药物发现 •相互作用研究 •生物标志物检测

Thermo Scientific微孔板检测仪选项

赛默飞科学公司提供采用多种检测模式的微孔板读数仪。Multiskan FC 微孔板光度计和Multiskan SkyHigh 微孔板分光光度计都能够进行吸光度和浊度测定，而Varioskan ALF 和Varioskan LUX 多模式微孔板读数仪可用于包括吸光度、浊度、荧光和发光在内的多种检测模式。Varioskan LUX是一款先进的多模式微孔板检测仪，同时兼容专门技术如时间分辨荧光和AlphaScreen/AlphaLISA检测。

微孔板检测仪通过滤光片或单色仪来隔离特定波长的光，用于不同检测模式下的照明和检测。滤光片允许一定带宽的光通过样品，而单色仪则将光分离为特定波长用于样品照明和检测。阅读博客“选择单色仪还是滤光片型微孔板检测仪？如何决策”以了解更多关于单色仪和滤光片型微孔板检测仪的优势与用途。

微孔板检测仪型号	检测模式
Multiskan FC（多功能FC）	吸收、浊度测量
Multiskan SkyHigh	吸收、浊度测量
Varioskan ALF	吸光度，浊度测定，荧光，发光
Varioskan LUX	吸光度，浊度测定，荧光。可选：时间分辨荧光（TRF）、发光、AlphaScreen/AlphaLISA