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Modification CRISPR knock-in et marquage des gènes |
Créez facilement de l’ADN donneur prêt à la transfection pour le marquage des gènes
Les outils et réactifs de conception Invitrogen offrent un moyen rapide et facile de créer de l’ADN donneur pour les marqueurs fluorescents, les marqueurs d’épitope ou les expériences précises de modification génétique à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9 ou TALEN. Les kits d’ADN de donneur Invitrogen TrueTag optimisent l’efficacité de modification et réduisent considérablement le temps de traitement par rapport aux produits concurrents, car les étapes de clonage ont été éliminées. Le kit est livré complet avec tous les réactifs nécessaires pour préparer l’ADN du donneur et des protocoles faciles à suivre pour garantir que même les utilisateurs débutants peuvent exécuter des knock-in réussis dans leur propre laboratoire.
- Obtenez jusqu’à 100 % de cellules modifiées : obtenez de bons résultats, quel que soit votre niveau d’expertise
- Éliminez les étapes de clonage : la PCR en une étape vous donne des donneurs en heures et non en jours
- Minimisez le temps de criblage : enrichissez les cellules modifiées à l’aide de blasticidine ou de puromycine
- Marquez facilement les gènes : ajoutez un marqueur fluorescent ou épitope de votre choix à une protéine d’intérêt
- Créez des lignées cellulaires de knock-out : associez le knock-out fonctionnel à des marqueurs de fluorescence et de sélection pour enrichir les cellules modifiées
Pour les petites insertions/délétions (jusqu’à 30 bases), nous vous recommandons d’utiliser le Invitrogen TrueDesign Genome Editor. Ce logiciel en ligne gratuit vous permet de concevoir et de commander des donneurs d’ARNg et d’ADNsb CRISPR pour les insertions, les délétions et les remplacements jusqu’à 30 bases.
| Type de modification génomique | TrueDesign Genome Editor | Kits d’ADN de donneur TrueTag |
|---|---|---|
| Modification SNP ou autre remplacement de ≤ 30 nt |  | |
| Délétion ou insertion de ≤ 30 nt | | |
| Insertion de codons d’arrêt pour un knock-out fonctionnel | | |
| Insertion de codons d’arrêt, de marqueurs fluorescents et de marqueurs de sélection pour le knock-out + enrichissement de cellules modifiées | | |
| Marqueur de gène fluorescent ou d’épitope | | |
Guide de sélection du kit d’ADN de donneur TrueTag pour les expériences TALEN ou CRISPR knock-in
| Kits fluorescents | Kits d’épitope | Kits Stem | Kit d’enrichissement par knock-out | |
|---|---|---|---|---|
| Objectif du kit | Marquage fluorescent d’une protéine exprimée | Marquage d’épitope d’une protéine exprimée | Marquage fluorescent d’un gène exprimé OU non exprimé | Knock-out fonctionnel d’un gène cible Marquage fluorescent & knock-in de codons d’arrêt |
| Marqueurs disponibles | GFP, RFP, BFP ou YFP | Myc, HA, 6xHis, DDK (DYKDDDDK ; marqueur FLAG®) | GFP ou RFP | GFP & RFP |
| Résistance aux antiobiotiques pour l’enrichissement des cellules modifiées | Puromocyine ou blasticidine | |||
| Suppression par Cre/Lox du marqueur de résistance après l’enrichissement | | | | |
| Expression du marqueur de fusion | | | | |
| Co-expression du marqueur fluorescent | | |||
| Détection d’anticorps du marqueur / modification | | |||
| Analyse/enrichissement FACS des cellules modifiées | | | | |
| Commander | Commander | Commander | Commander | |
Données d’échantillons du marquage de gènes à l’aide des kits de donneur d’ADN TrueTag
Données : Ajoutez un marqueur fluorescent à l’extrémité C ou N-terminale d’une protéine endogène
Les kits d’ADN de donneur TrueTag offrent quatre choix de marqueurs fluorescents (EmGFP, tagRFP, tagBFP, tagYFP) pour la création directe de lignées cellulaires de rapporteurs pour comprendre la localisation des protéines. Les marqueurs peuvent être ajoutés à l’extrémité N ou C-terminale du gène endogène et inclure un marqueur de sélection pour l’enrichissement des cellules modifiées.
Figure 1. Knock-in TrueTag vers les cellules U2OS. Les cellules U2OS ont été transfectées avec TrueCut Cas9 v2, un donneur d’ADNdb TrueTag pour la réparation dirigée par l’homologie (HDR) afin d’insérer la GFP à l’extrémité N ou C-terminale du locus ACTB et un ARNg TrueGuide pour l’extrémité N ou C-terminale d’ACTB. La transfection a été réalisée avec le réactif Lipofectamine CRISPRMAX. Sept jours après la transfection, les cellules ont été contre-colorées avec le réactif NucBlue Live ReadyProbes et les images ont été enregistrées sur un système d’imagerie couleur EVOS FL.
Données : Marquage d’épitope d’ACTB dans les cellules U2OS
Les marqueurs d’épitope sont utilisés pour la détection et la purification à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique au marqueur d’épitope. Le marquage avec un épitope est utile lorsque vous travaillez avec de nouvelles protéines ou des cibles ne disposant pas d’un anticorps fiable. Les kits d’ADN de donneur TrueTag offrent des marqueurs exprimant l’hémagglutinine (HA) de la grippe humaine, la protéine dérivée de c-Myc (Myc), la polyhistidine (6xHis) et l’octopeptide FLAG DYKDDDDK (DDK).
Figure 2. Marquage d’épitope d’ACTB dans les cellules U2OS. L’ARNg et les amorces adaptatrices pour le marquage C-terminal du gène de la bêta-actine humaine ont été conçus par le TrueDesign Genome Editor et l’ADN de donneur a été préparé à l’aide du kit d’ADN de donneur TrueTag, HA. L’ADN du donneur a été préparé par PCR en une étape à l’aide de modèles d’ADN de donneur C-3XHA contenant soit un marqueur de sélection de la puromycine ou de la blasticidine Le produit PCR obtenu (500 ng) a été co-délivré avec les complexes de protéines Cas9 TrueCut v2/ARNg (RNP) (500 ng Cas9/125 ng ARNsg) dans 2 x105 cellules U2OS dans une plaque à 24 puits utilisant le réactif de transfection Lipofectamine CRISPRMAX Cas9. 48 heures après la transfection, les cellules ont été divisées en 1:4 puis traitées avec 0, 0,75 µg/ml ou 1 µg/ml de puromycine ou 0, 8 µg/ml ou 12 µg/ml de blasticidine pendant 5 à 7 jours. (A) Après sélection d’antibiotiques, des aliquotes de cellules ont été ensemencées sur des lamelles couvre-objets, fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %, perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,1 % et colorées avec l’anticorps monoclonal HA Tag (2-2.2.14), DyLight 488. Les réactifs Texas Red-X Phalloidin et NucBlue Live ReadyProbes ont été utilisés pour marquer le cytosquelette et le noyau des cellules. Les cellules ont ensuite été imagées à l’aide de la plateforme d’analyse de haute densité (HCA) Thermo Scientific CellInsight CX7. (B) Après expansion dans des plaques à 6 puits, les cellules ont été récoltées et lysées dans un tampon de lyse Pierce IP d’environ 100 µl complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase. Un aliquot de 20 µl de surnageant a été analysé par des gels protéiques de type NuPAGE 4-12 % Bis-Tris. Le lysat cellulaire non transfecté a été utilisé comme contrôle négatif. Les protéines fractionnées ont été transférées sur une membrane de nitrate de cellulose à l’aide du dispositif de transfert de gel iBlot 2. La membrane a été bloquée pendant 30 à 60 minutes puis incubée pendant la nuit avec l’anticorps monoclonal HA Tag (2-2.2.14) à une dilution de 1:1 000. Après lavage, la membrane a été incubée avec l’anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à HRP à une dilution de 1:2 000 pendant 30 à 60 minutes. Après un lavage approfondi, la membrane a été développée avec le substrat à durée prolongée SuperSignal West Dura et imagée avec iBright. Les anticorps contre la GAPDH ont été utilisés comme contrôles de charge.
Données : Combinez les marqueurs RFP et GFP pour suivre deux protéines dans la même lignée cellulaire
Figure 3. Double marquage des cellules HEK293 avec GFP et RFP. Les cellules 293FT ont été transfectées avec la protéine TrueCut Cas9 v2, un donneur d’ADNdb TrueTag pour la réparation dirigée par l’homologie (HDR) au terminal C du locus HIST1H4C avec GFP-puromycine, un deuxième donneur d’ADNdb TrueTag pour la HDR au terminal N du locus ACTB avec blasticidine-RFP, et un ARNg synthétique TrueGuide ciblant chaque locus génomique. La transfection a été réalisée avec le réactif Lipofectamine CRISPRMAX. Une pression sélective a été appliquée aux cellules 293FT pour générer un pool stable : cinq jours de sélection à la blasticidine ont d’abord été effectués, suivis de cinq jours de sélection à la puromycine. Les cellules ont été contre-colorées avec le réactif NucBlue Live ReadyProbes et les images ont été capturées sur un système d’imagerie couleur EVOS FL.
Réduisez la préparation de l’ADN de donneur de plusieurs jours à quelques heures et éliminez les étapes de clonage
Cliquez sur l’image pour l’agrandir
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Figure 4. Comparaison du flux de travaux du kit d’ADN de donneur TrueTag et du flux de travaux de knock-in par recombinaison homologue d’un conccurent. Le flux de travaux TrueTag peut être déroulé en quelques heures et est aussi simple que la réalisation d’une PCR unique, colonne purifiant le produit d’ADN double brin, puis transfectant le donneur (avec les nucléases effectrices appropriées CRISPR-Cas9 ou nucléases effectrices TAL) pour introduire le marqueur dans votre gène d’intérêt. À l’inverse, les kits concurrents nécessitent plusieurs conceptions d’amorces et des étapes de PCR pour assembler la molécule de donneur dans un vecteur de colonne de base, puis un sous-clonage. Cela nécessite un dépistage supplémentaire des colonies d’E. coli ainsi qu’une vérification de la séquence. L’ensemble du processus prend plusieurs jours. Le système TrueTag permet de générer des molécules de donneur en quelques heures seulement.
Flux de travaux de marquage de gènes C-terminal
Figure 5. Présentation du flux de travaux consistant à marquer les gènes C-terminal à l’aide des kits d’ADN de donneur TrueTag.
Données : Générez des lignées cellulaires stables CRISPR knock-in avec des marqueurs GFP
La création de lignées cellulaires marquées stables est facilitée grâce aux marqueurs de sélection inclus dans tous les modèles d’ADN de donneur TrueTag. L’application d’une pression sélective avec de la blasticidine ou de la puromycine (Figure 6) montre une génération réussie d’une population cellulaire avec >99 % de cellules exprimant le marqueur GFP.
Figure 6. Lignées cellulaires stables générées en 10 jours. Au jour 1, les cellules 293FT sont transfectées avec TrueCut Cas9 v2, un donneur d’ADNdb TrueTag pour la réparation dirigée par l’homologie au terminal C du locus ACTB pour l’insertion de GFP-puromycine et un ARNg TrueGuide pour le terminal C d’ACTB, avec le réactif Lipofectamine CRISPRMAX. La génération de donneur TrueTag est un processus rapide qui prend 3 heures ou moins. Au jour 3 ou 4, la réparation dirigée par l’homologie est terminée et le marqueur de fusion est exprimé hors des loci natifs. Environ 25 % des cellules de cet exemple étaient positives pour la GFP. La sélection peut commencer 72 à 96 heures après la transfection. Au jour 10, cette population de cellules dont la stabilité est sélectionnée avec la puromycine >est positive à 99 % pour la GFP. Données collectées sur un cytomètre en flux Attune NxT.
Données : Les cellules iPSS marquées expriment le marqueur GFP suite à leur différenciation en astrocytes
La protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) est une protéine de filament intermédiaire de type III qui est exprimée par de nombreux types de cellules, y compris les astrocytes, au cours du développement du système nerveux central. Grâce au kit TrueTag GFP Stem, des cellules iPS ont été marquées au niveau de leur gène GFAP, enrichies à l’aide du marqueur de sélection et différenciées en astrocytes. Lors de la différenciation, le knock-in TrueTag a exprimé le marqueur GFAP de la protéine GFAP.
Figure 7. Marquage GFP stable de la GFAP et différenciation des iPSC en astrocytes. Le gène GFAP endogène a été marqué avec EmGFP à son extrémité C-terminale dans les iPSC à l’aide du kit d’ADN de donneur TrueTag, GFP Stem. Les lignées cellulaires rapporteuses GFAP-EmGFP iPSC qui en résultent ont ensuite été soumises à une induction neurale PSC à l’aide du milieu d’induction neurale de la PSC. Les PSC qui en résultent ont ensuite été différenciés en astrocytes à l’aide d’un milieu de différenciation des astrocytes. (A) Quelques cellules GFP+ ont été détectées à peu près au jour 18 de la différenciation, alors que la plupart des cellules étaient positives pour la GFP au jour 45. (B) Pour confirmer que le signal GFP est dirigé par l’expression du gène GFAP, les cellules ont été colorées avec un anticorps anti-GFAP conjugué à l’eFluor 570. La coloration rouge a confirmé que l’expression GFAP était superposée à celle de la GFP, ce qui indique que le signal de la GFP était dû à l’expression de la protéine GFAP dans les astrocytes.
Données : La stratégie de marquage fluorescent à double enrichissement permet d’obtenir une population de knock-out à 100 % en seulement dix jours
Figure 8. Enrichissement efficace des cellules avec knock-out HPRT en utilisant le tri FACS et la double sélection. (En haut) Les cellules HEK293FT ont été transfectées avec la RNP Cas9 et 250 ng chacune d’ADN de donneur GFP-Bsd et RFP-Puro ciblant le gène HPRT humain. Les donneurs ont été préparés à l’aide du kit d’ADN de donneur d’enrichissement TrueTag Knockout. 48 heures après la transfection, les cellules transfectées ont été sélectionnées avec 0,5 µg/ml de puromycine et 16 µg/ml de blasticidine pendant dix jours pour éliminer la population cellulaire non intégrée. Les pourcentages de cellules positives GFP+ et RFP+ ont été déterminés par analyse cytométrique en flux. Les cellules bipositives GFP/RFP ont été enrichies à l’aide d’un trieur cellulaire. Comparées aux cellules parentales témoins, les cellules triées présentaient >80 % de cellules GFP+ et RFP+. (En bas) Les résultats de transfert Western démontrent une diminution de HPRT sous différents traitements à la puromycine/blasticidine et populations cellulaires triées/non triées. Dans trois séries de conditions, par rapport aux cellules parentales témoins (Neg), les cellules enrichies ont atteint un knock-out de 100 % d’HPRT.
Flux de travaux du kit d’ADN de donneur d’enrichissement TrueTag Knockout
Figure 9. Un aperçu du flux de travaux d’enrichissement knock-out à l’aide du kit d’ADN de donneur d’enrichissement TrueTag Knockout.
Données : Ajoutez un marqueur fluorescent à l’extrémité C ou N-terminale d’une protéine endogène
Les kits d’ADN de donneur TrueTag offrent quatre choix de marqueurs fluorescents (EmGFP, tagRFP, tagBFP, tagYFP) pour la création directe de lignées cellulaires de rapporteurs pour comprendre la localisation des protéines. Les marqueurs peuvent être ajoutés à l’extrémité N ou C-terminale du gène endogène et inclure un marqueur de sélection pour l’enrichissement des cellules modifiées.
Figure 1. Knock-in TrueTag vers les cellules U2OS. Les cellules U2OS ont été transfectées avec TrueCut Cas9 v2, un donneur d’ADNdb TrueTag pour la réparation dirigée par l’homologie (HDR) afin d’insérer la GFP à l’extrémité N ou C-terminale du locus ACTB et un ARNg TrueGuide pour l’extrémité N ou C-terminale d’ACTB. La transfection a été réalisée avec le réactif Lipofectamine CRISPRMAX. Sept jours après la transfection, les cellules ont été contre-colorées avec le réactif NucBlue Live ReadyProbes et les images ont été enregistrées sur un système d’imagerie couleur EVOS FL.
Données : Marquage d’épitope d’ACTB dans les cellules U2OS
Les marqueurs d’épitope sont utilisés pour la détection et la purification à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique au marqueur d’épitope. Le marquage avec un épitope est utile lorsque vous travaillez avec de nouvelles protéines ou des cibles ne disposant pas d’un anticorps fiable. Les kits d’ADN de donneur TrueTag offrent des marqueurs exprimant l’hémagglutinine (HA) de la grippe humaine, la protéine dérivée de c-Myc (Myc), la polyhistidine (6xHis) et l’octopeptide FLAG DYKDDDDK (DDK).
Figure 2. Marquage d’épitope d’ACTB dans les cellules U2OS. L’ARNg et les amorces adaptatrices pour le marquage C-terminal du gène de la bêta-actine humaine ont été conçus par le TrueDesign Genome Editor et l’ADN de donneur a été préparé à l’aide du kit d’ADN de donneur TrueTag, HA. L’ADN du donneur a été préparé par PCR en une étape à l’aide de modèles d’ADN de donneur C-3XHA contenant soit un marqueur de sélection de la puromycine ou de la blasticidine Le produit PCR obtenu (500 ng) a été co-délivré avec les complexes de protéines Cas9 TrueCut v2/ARNg (RNP) (500 ng Cas9/125 ng ARNsg) dans 2 x105 cellules U2OS dans une plaque à 24 puits utilisant le réactif de transfection Lipofectamine CRISPRMAX Cas9. 48 heures après la transfection, les cellules ont été divisées en 1:4 puis traitées avec 0, 0,75 µg/ml ou 1 µg/ml de puromycine ou 0, 8 µg/ml ou 12 µg/ml de blasticidine pendant 5 à 7 jours. (A) Après sélection d’antibiotiques, des aliquotes de cellules ont été ensemencées sur des lamelles couvre-objets, fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %, perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,1 % et colorées avec l’anticorps monoclonal HA Tag (2-2.2.14), DyLight 488. Les réactifs Texas Red-X Phalloidin et NucBlue Live ReadyProbes ont été utilisés pour marquer le cytosquelette et le noyau des cellules. Les cellules ont ensuite été imagées à l’aide de la plateforme d’analyse de haute densité (HCA) Thermo Scientific CellInsight CX7. (B) Après expansion dans des plaques à 6 puits, les cellules ont été récoltées et lysées dans un tampon de lyse Pierce IP d’environ 100 µl complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase. Un aliquot de 20 µl de surnageant a été analysé par des gels protéiques de type NuPAGE 4-12 % Bis-Tris. Le lysat cellulaire non transfecté a été utilisé comme contrôle négatif. Les protéines fractionnées ont été transférées sur une membrane de nitrate de cellulose à l’aide du dispositif de transfert de gel iBlot 2. La membrane a été bloquée pendant 30 à 60 minutes puis incubée pendant la nuit avec l’anticorps monoclonal HA Tag (2-2.2.14) à une dilution de 1:1 000. Après lavage, la membrane a été incubée avec l’anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à HRP à une dilution de 1:2 000 pendant 30 à 60 minutes. Après un lavage approfondi, la membrane a été développée avec le substrat à durée prolongée SuperSignal West Dura et imagée avec iBright. Les anticorps contre la GAPDH ont été utilisés comme contrôles de charge.
Données : Combinez les marqueurs RFP et GFP pour suivre deux protéines dans la même lignée cellulaire
Figure 3. Double marquage des cellules HEK293 avec GFP et RFP. Les cellules 293FT ont été transfectées avec la protéine TrueCut Cas9 v2, un donneur d’ADNdb TrueTag pour la réparation dirigée par l’homologie (HDR) au terminal C du locus HIST1H4C avec GFP-puromycine, un deuxième donneur d’ADNdb TrueTag pour la HDR au terminal N du locus ACTB avec blasticidine-RFP, et un ARNg synthétique TrueGuide ciblant chaque locus génomique. La transfection a été réalisée avec le réactif Lipofectamine CRISPRMAX. Une pression sélective a été appliquée aux cellules 293FT pour générer un pool stable : cinq jours de sélection à la blasticidine ont d’abord été effectués, suivis de cinq jours de sélection à la puromycine. Les cellules ont été contre-colorées avec le réactif NucBlue Live ReadyProbes et les images ont été capturées sur un système d’imagerie couleur EVOS FL.
Réduisez la préparation de l’ADN de donneur de plusieurs jours à quelques heures et éliminez les étapes de clonage
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Figure 4. Comparaison du flux de travaux du kit d’ADN de donneur TrueTag et du flux de travaux de knock-in par recombinaison homologue d’un conccurent. Le flux de travaux TrueTag peut être déroulé en quelques heures et est aussi simple que la réalisation d’une PCR unique, colonne purifiant le produit d’ADN double brin, puis transfectant le donneur (avec les nucléases effectrices appropriées CRISPR-Cas9 ou nucléases effectrices TAL) pour introduire le marqueur dans votre gène d’intérêt. À l’inverse, les kits concurrents nécessitent plusieurs conceptions d’amorces et des étapes de PCR pour assembler la molécule de donneur dans un vecteur de colonne de base, puis un sous-clonage. Cela nécessite un dépistage supplémentaire des colonies d’E. coli ainsi qu’une vérification de la séquence. L’ensemble du processus prend plusieurs jours. Le système TrueTag permet de générer des molécules de donneur en quelques heures seulement.
Flux de travaux de marquage de gènes C-terminal
Figure 5. Présentation du flux de travaux consistant à marquer les gènes C-terminal à l’aide des kits d’ADN de donneur TrueTag.
Données : Générez des lignées cellulaires stables CRISPR knock-in avec des marqueurs GFP
La création de lignées cellulaires marquées stables est facilitée grâce aux marqueurs de sélection inclus dans tous les modèles d’ADN de donneur TrueTag. L’application d’une pression sélective avec de la blasticidine ou de la puromycine (Figure 6) montre une génération réussie d’une population cellulaire avec >99 % de cellules exprimant le marqueur GFP.
Figure 6. Lignées cellulaires stables générées en 10 jours. Au jour 1, les cellules 293FT sont transfectées avec TrueCut Cas9 v2, un donneur d’ADNdb TrueTag pour la réparation dirigée par l’homologie au terminal C du locus ACTB pour l’insertion de GFP-puromycine et un ARNg TrueGuide pour le terminal C d’ACTB, avec le réactif Lipofectamine CRISPRMAX. La génération de donneur TrueTag est un processus rapide qui prend 3 heures ou moins. Au jour 3 ou 4, la réparation dirigée par l’homologie est terminée et le marqueur de fusion est exprimé hors des loci natifs. Environ 25 % des cellules de cet exemple étaient positives pour la GFP. La sélection peut commencer 72 à 96 heures après la transfection. Au jour 10, cette population de cellules dont la stabilité est sélectionnée avec la puromycine >est positive à 99 % pour la GFP. Données collectées sur un cytomètre en flux Attune NxT.
Données : Les cellules iPSS marquées expriment le marqueur GFP suite à leur différenciation en astrocytes
La protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) est une protéine de filament intermédiaire de type III qui est exprimée par de nombreux types de cellules, y compris les astrocytes, au cours du développement du système nerveux central. Grâce au kit TrueTag GFP Stem, des cellules iPS ont été marquées au niveau de leur gène GFAP, enrichies à l’aide du marqueur de sélection et différenciées en astrocytes. Lors de la différenciation, le knock-in TrueTag a exprimé le marqueur GFAP de la protéine GFAP.
Figure 7. Marquage GFP stable de la GFAP et différenciation des iPSC en astrocytes. Le gène GFAP endogène a été marqué avec EmGFP à son extrémité C-terminale dans les iPSC à l’aide du kit d’ADN de donneur TrueTag, GFP Stem. Les lignées cellulaires rapporteuses GFAP-EmGFP iPSC qui en résultent ont ensuite été soumises à une induction neurale PSC à l’aide du milieu d’induction neurale de la PSC. Les PSC qui en résultent ont ensuite été différenciés en astrocytes à l’aide d’un milieu de différenciation des astrocytes. (A) Quelques cellules GFP+ ont été détectées à peu près au jour 18 de la différenciation, alors que la plupart des cellules étaient positives pour la GFP au jour 45. (B) Pour confirmer que le signal GFP est dirigé par l’expression du gène GFAP, les cellules ont été colorées avec un anticorps anti-GFAP conjugué à l’eFluor 570. La coloration rouge a confirmé que l’expression GFAP était superposée à celle de la GFP, ce qui indique que le signal de la GFP était dû à l’expression de la protéine GFAP dans les astrocytes.
Données : La stratégie de marquage fluorescent à double enrichissement permet d’obtenir une population de knock-out à 100 % en seulement dix jours
Figure 8. Enrichissement efficace des cellules avec knock-out HPRT en utilisant le tri FACS et la double sélection. (En haut) Les cellules HEK293FT ont été transfectées avec la RNP Cas9 et 250 ng chacune d’ADN de donneur GFP-Bsd et RFP-Puro ciblant le gène HPRT humain. Les donneurs ont été préparés à l’aide du kit d’ADN de donneur d’enrichissement TrueTag Knockout. 48 heures après la transfection, les cellules transfectées ont été sélectionnées avec 0,5 µg/ml de puromycine et 16 µg/ml de blasticidine pendant dix jours pour éliminer la population cellulaire non intégrée. Les pourcentages de cellules positives GFP+ et RFP+ ont été déterminés par analyse cytométrique en flux. Les cellules bipositives GFP/RFP ont été enrichies à l’aide d’un trieur cellulaire. Comparées aux cellules parentales témoins, les cellules triées présentaient >80 % de cellules GFP+ et RFP+. (En bas) Les résultats de transfert Western démontrent une diminution de HPRT sous différents traitements à la puromycine/blasticidine et populations cellulaires triées/non triées. Dans trois séries de conditions, par rapport aux cellules parentales témoins (Neg), les cellules enrichies ont atteint un knock-out de 100 % d’HPRT.
Flux de travaux du kit d’ADN de donneur d’enrichissement TrueTag Knockout
Figure 9. Un aperçu du flux de travaux d’enrichissement knock-out à l’aide du kit d’ADN de donneur d’enrichissement TrueTag Knockout.
Kit d’ADN de donneur TrueTag, FAQ
La génération de votre construction d’ADN de donneur nécessite très peu d’expertise en biologie moléculaire. En plus du kit TrueTag fournissant des modèles, des éléments essentiels pour la PCR et des réactifs de nettoyage, le logiciel TrueDesign Genome Editor vous guide à travers chaque étape de conception avec une interface simple et facile d’utilisation. Il générera l’ARN guide CRISPR requis, les amorces d’amplification avec les bras d’homologie et les amorces de vérification en quelques minutes, grâce à la fonctionnalité pratique Ajouter au panier.
Oui, le système TrueTag est disponible avec quatre marqueurs fluorescents différents (GFP, RFP, BFP ou YFP) qui fonctionnent avec les ensembles de filtres les plus courants des microscopes qui utilisent la détection par fluorescence. Il permet également le marquage et la visualisation simultanés de différentes protéines.
Les kits TrueTag Stem sont conçus pour ce type d’expérience. Le marqueur de sélection est piloté par son propre promoteur, de sorte que l’enrichissement peut se produire en l’absence de l’expression génétique endogène, ce qui entraîne également l’expression du marqueur fluorescent.
Vous devrez le déterminer en fonction des résultats souhaités de votre expérience. Si vous souhaitez éliminer tous les allèles connus, vous devrez sélectionner une région dans un transcript qui est partagé par toutes les variantes d’épissage. Si vous ne souhaitez exclure qu’une certaine variante, vous devrez choisir une région unique à ce transcript. Le logiciel TrueDesign se connecte directement à NCBI pour faciliter l’accès à la topologie la plus récente des transcripts afin de vous aider à prendre cette décision.
Les kits d’enrichissement KO sont conçus pour répondre à cette question. En utilisant des combinaisons de deux fluorophores et de marqueurs de résistance (p. ex. GFP:Blast et RFP:Puro), vous pouvez effectuer un double enrichissement pour isoler les cellules qui contiennent une de chaque construction et donc une cassette KO dans chaque allèle
Les kits TrueTag Stem comprennent un promoteur CMV pour diriger l’expression du marqueur de résistance aux antibiotiques indépendamment du promoteur du gène endogène. De cette façon, l’enrichissement peut avoir lieu immédiatement et l’expression du fluorophore ne sera induite que lorsque la protéine d’intérêt sera exprimée.
Les marqueurs de résistance dans toutes les constructions TrueTag peuvent être supprimés à l’aide du système Cre/Lox.
Il est généralement recommandé de marquer l’extrémité C-terminale pour éviter toute interférence avec la traduction de la protéine native. Dans le cas des kits TrueTag Stem, l’extrémité C-terminale est la seule option.
Commandez des kits d’ADN de donneur TrueTag
Produits associés au CRISPR
Ressources et assistance pour la modification CRISPR knock-in et le marquage des gènes
Gene editing resources and support
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For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.