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RNAトランスフェクションのためのガイドラインと最適化方法

Written by | Published: 02.16.2017

RNAのトランスフェクションは、RNAを細胞に導入するための古典的なトランスフェクション技術から派生しています。RNAトランスフェクションの目的は、プラスミドトランスフェクションに類似します。mRNAが細胞に導入されると、コードされているタンパク質が発現され、遺伝子の機能および調節に関する研究が可能となります。siRNAは、遺伝子ノックダウンの効果について調べるためのRNAi研究に使用されます。この2つの方法の1つの大きな違いは、RNAのみを一過的にトランスフェクションできることです。

今回は、RNAを用いたトランスフェクションについてのガイドラインとパラメータの最適化方法についてご紹介します。

RNAトランスフェクションのためのガイドライン

RNAiのワークフロー

siRNAのデザインおよび合成から始まるRNAi実験のワークフローを下図に示します。以下のご用意があるかを確認した上でRNAi実験を実施します。

  • トランスフェクション／エレクトロポレーション試薬およびプロトコール
  • ノックダウンおよび他のRNAiの効果について評価するためのアッセイ
  • ポジティブおよびネガティブコントロールsiRNA
  • 2つ以上のsiRNAの目的遺伝子への導入
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図 siRNAのデザインおよび合成から始まるRNAi実験のワークフロー

RNAの取り扱い

RNAオリゴヌクレオチドは、取り扱い中に混入した外来性リボヌクレアーゼによる分解を受けやすい傾向があります。

  • RNAを取り扱う際は手袋を着用します。
  • トランスフェクション用のRNAを調製する際は、RNaseフリーの試薬、チューブ、およびバリアピペットチップを使用します。
  • 作業エリアは、70%エタノールまたはRNaseZap™ RNase Decontamination SolutionなどのRNase除去溶液を使用してしっかりと拭きます。

トランスフェクション効率

siRNAの哺乳類細胞へのトランスフェクション効率は、使用する細胞タイプおよびトランスフェクション試薬によって異なります。これは、トランスフェクションに最適な濃度は経験的に決定する必要があることを意味します。siRNAトランスフェクション効率に影響を与える主な要素を以下に示します。

  • トランスフェクション試薬の種類および量
  • ウェルにプレーティングした細胞数
  • RNAまたはsiRNAのタイプ
  • RNAまたはsiRNAの濃度

ポジティブコントロール

ポジティブコントロールを実験ごとに設定することは重要です。ポジティブコントロールは、再現性があり、細胞における反応を簡単に測定でき、目的の研究において使用されるアッセイである必要があります。最大効果がこのコントロールの規定の閾値レベル前後であった場合、同日にテストした他の実験における測定値は信頼できます。各アッセイの閾値およびコントロールペアは経験的に決定することが重要であることには留意する必要があります。

特定のRNAまたはsiRNAに対する反応の程度がそのトランスフェクション効率に直結します。トランスフェクション効率を確認するためには、実験ごとにBLOCK-iT™ Fluorescent Oligoを使用することを推奨します。トランスフェクション実験にBLOCK-iT Fluorescent Oligoを使用すると、あらゆる蛍光顕微鏡および標準的なFITCフィルターセットを使用して、オリゴマーの取り込みおよびトランスフェクション効率を簡単に評価できます。蛍光オリゴマーの取り込み率が少なくとも80%以上であると、高効率と評価されます。

ネガティブコントロール

ネガティブコントロールは、意味のあるデータを取得するためにポジティブコントロールと同じように重要です。常に、少なくとも1種類のネガティブコントロールを等モル量使用した一連のトランスフェクションを並行して行い、ターゲットRNAまたはsiRNAで処理した細胞およびコントロールで処理した細胞の効果を比較します。これらの重要なコントロールから得られるデータは、実験ターゲットのノックダウンを評価するためのベースラインです。

非トランスフェクト細胞または細胞のみのネガティブコントロールも非常に有用です。トランスフェクションしていない培養と非ターゲティングネガティブコントロールをトランスフェクションした培養におけるハウスキーピング遺伝子の発現を比較することにより、トランスフェクションの細胞生存率への影響に関する有益な情報を得ることができます。

表 コントロールのタイプと推奨用途
コントロールのタイプ 推奨用途 推奨製品
トランスフェクションコントロール 蛍光によるトランスフェクション効率の算出およびモニター
 ネガティブコントロール  バックグラウンドに対するノックダウンレベルを測定するための非特異的またはスクランブルコントロール
ポジティブコントロール 高レベルでノックダウンを達成することで知られるRNAi試薬の使用による導入効率のモニターおよび実験条件の最適化
非導入コントロール 正常遺伝子発現レベルおよび表現型の測定
同一ターゲットに対する複数のRNAi配列 表現型変化の確認、publication qualityの結果を獲得するためのオフターゲット効果のコントロールに使用
RNAiの滴定 細胞の正常プロセスの変化を回避する最低有効濃度での使用
レスキュー実験 誘導RNAiの解除またはRNAi配列が影響しない標的mRNAを発現するプラスミドの導入 BLOCK-iT Pol II miR RNAiまたはBLOCK-iT shRNAベクター＋誘導性プロモーター（それぞれCMV/TOおよびH1/TO）

コトランスフェクション

コトランスフェクションは、siRNAとタンパク質を発現させるためのプラスミドを同時に細胞に導入する際に実施されます。このタンパク質は試験システムの一部、またはほとんどのケースにおいて存在し、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、GFP、β-ラクタマーゼ）でもあり得ます。ケースによっては、siRNAとともに変異タンパク質を発現させて、siRNAの1つのパスウェイをブロックし、変異タンパク質を過剰発現させることが望まれます。

脂質トランスフェクション試薬を使用する場合、プラスミドの存在は全てのカーゴ（プラスミドおよびsiRNA）のトランスフェクション効率を低下させる可能性があるため、トランスフェクションの最適化は非常に重要です。脂質が多過ぎる場合、望まれない、非特異的な細胞死が生じる可能性があります。あるいは、トランスフェクション条件が最適でない場合、ノックダウン効率が低過ぎたり、プラスミド由来のタンパク質発現が生じる可能性があります。

siRNAの品質

siRNAの品質はRNAi実験に著しく影響を及ぼします。siRNAには、合成の際に使用されるエタノール、塩、およびタンパク質などの試薬がキャリーオーバーされないようにする必要があります。また、30 bpより長いdsRNA夾雑物は、非特異的インターフェロン応答を活性化し、細胞毒性を引き起こすことにより遺伝子発現を変化させることが知られています（Stark et al., 1998）。このため、80%以上の完全長の標準純度のsiRNAを使用することを推奨します。

siRNAの保存

siRNAは –20°Cまたは –80°Cに設定されたフリーザーで、霜がつかない状態で保存します。弊社のデータでは、50回の凍結融解サイクルでは、100 μM溶液のsiRNAは損傷しないことが示されています（質量スペクトルおよび分析HPLCによる評価において）。しかし、汚染の可能性を回避するために、siRNAは、RNaseフリーの水またはバッファーに再懸濁し、小分け分注して保存することをお薦めします。

siRNAのヌクレアーゼに対する安定性

アニールし、形成された二本鎖siRNAは、一本鎖RNAよりもヌクレアーゼ分解に対する安定性が向上しています。しかし、RNAi実験は、全プロセスにおいて厳格なRNaseフリーの手法で行う必要があります。

siRNA分解の確認

siRNA調製物の分解が疑われる場合、約2.5 μgを非変性15–20%アクリルアミドゲル上で電気泳動することによってsiRNAの完全性を確認します。RNAをエチジウムブロマイドで染色して可視化し、予測されるサイズおよび完全性を確認します。siRNAはタイトなバンドとして移動することが望まれ、スメアなバンドが認められる場合は分解している可能性があります。

siRNAの量

siRNAの最適量および遺伝子サイレンシングのための能力は、mRNAの局在化、安定性、存在量、ならびに標的タンパク質の安定性および存在量を含む、ターゲット遺伝子産物の特性の影響を部分的に受けます。

多くのsiRNA実験は、現在も100 nMのsiRNAを細胞にトランスフェクションさせることにより行われていますが、siRNAをより低濃度でトランスフェクションさせると、siRNAにより生じるオフターゲット効果を低減できるという結果が報告されています（Jackson et al., 2003; Semizarov et al., 2003）。脂質媒介性リバーストランスフェクションでは、10 nMのsiRNA（1～30 nMの範囲）で通常十分とされます。エレクトロポレーションを用いるsiRNA導入では、siRNA量の影響は低いと言われていますが、通常1 μg/50 μL細胞（1.5 μM）のsiRNA（0.5～2.5 μg/50 μL細胞または0.75～3.75 μMの範囲）で十分とされます。

siRNA濃度が高過ぎるとオフターゲットや細胞毒性につながり、siRNA濃度が低過ぎると標的遺伝子の発現効率が低下することには留意する必要があります。非常に多くの変数が関与するため、使用する細胞系ごとにsiRNA量を最適化することが重要です。また、非ターゲティングネガティブコントロールsiRNAの量は、実験に使用するsiRNAと同量にする必要があります。

トランスフェクション試薬の量

トランスフェクション試薬の量は、少な過ぎるとトランスフェクションが制限され、多過ぎると毒性を示すことから、最適化すべき極めて重要なパラメータです。全トランスフェクション効率は、siRNAと複合体を形成したトランスフェクション試薬の量に影響されます。最適化するためには、トランスフェクション試薬を幅広い希釈範囲で濃度設定し、遺伝子ノックダウンを行える最小濃度を選択します。この境界濃度は、細胞ごとに経験的に決定する必要があります。

細胞密度

細胞密度は、細胞をプレーティングしてからトランスフェクションする従来の方法では重要ですが、リバーストランスフェクションによりsiRNAを細胞に導入する場合はそれほど重要でなく、最適化はほとんどまたは全く必要ありません。しかし、非常に多くの細胞を使用し、siRNA量が比例的に増加しない場合は、サンプル中のsiRNA濃度が遺伝子サイレンシングを効率的に誘発するのに低過ぎる可能性があります。細胞密度が低過ぎる場合は、培養が不安定になる可能性があります。マルチウェルプレート全体の培養条件（例えば、pH、温度）は一定でなく、培養に与える不安定さの影響も異なるため、不安定さはウェルによって異なる可能性があります。

トランスフェクション試薬への曝露/siRNA複合体

大部分のトランスフェクション試薬は細胞毒性が最小限になるようにデザインされていますが、細胞を曝露するトランスフェクション試薬が多すぎる、あるいは曝露が長時間であると、細胞培養の全般的な健全性が損なわれる可能性があります。センシティブな細胞は、トランスフェクション試薬に曝露後数時間で死滅し始めることもあります。トランスフェクションによってご使用の細胞に過度の細胞死が生じた場合は、トランスフェクション溶液を除去し、8～24時間後に新しい増殖培地を補充します。

トランスフェクション中の血清の存在

トランスフェクション試薬とsiRNAとの複合体形成は、血清成分が反応を妨げないように血清を減量または含まない培地で行う必要があります。しかし、いったん複合体が形成されると、一部のトランスフェクション試薬では、血清を含む通常の増殖培地においてトランスフェクションを行うことができます（製造元のインストラクションに従ってください）。トランスフェクション後の培養培地の添加や交換は通常必要とされませんが、血清が適合する試薬を使用している場合でも、培地交換が有益である場合があります。特殊な試薬を使用する前には血清との適合性について必ず確認するようにしてください。一部のトランスフェクション試薬では、トランスフェクション中に血清不含培地が必要とされ、最初のトランスフェクション複合体とのインキュベーション後に完全増殖培地に交換する必要があります。

siRNA実験を成功させるためのコツ

  1. 1遺伝子につき2～4種類のsiRNA配列をデザインおよびテストする　ご自分でsiRNAをデザインする必要はありません。こちらのウェブサイトにアクセスして、最高クラスのデザインアルゴリズムを使用して、siRNAをデザインしてください。
  2. RNase汚染を回避する!　微量のリボヌクレアーゼであっても、siRNA実験を妨げる可能性があります。RNaseは、研究室の環境中- 肌、空気、素手で触ったもの、空気中に開けたままにして置いたもの全てに存在しているため、RNaseの汚染の防止および除去に対処することが重要です。弊社では、RNaseを検出および除去するための完全な製品ラインナップを提供しています。
  3. 繰り返し良好な効率でトランスフェクションするために健全な細胞培養および厳格なプロトコールを維持する　通常、健全な細胞には健全性が低い細胞よりも高い効率でトランスフェクションされます。少ない継代数でルーチンに細胞を継代することにより、1つの実験から次の実験までの連続細胞系の不安定性を最小限に抑えることができます。トランスフェクション効率は経時的に低下するため、実験を最適化する場合は50継代以内の細胞にトランスフェクションすることを推奨します。
  4. 抗生物質の使用を回避する　プレーティング中およびトランスフェクション後72時間までは抗生物質の使用を回避します。透過性細胞では、抗生物質が毒性レベルまで蓄積することが示されています。また、一部の細胞とトランスフェクション試薬は、最適なsiRNA導入のために無血清条件が必要とします。そのため、通常の増殖培地と無血清培地の両方において試験的にトランスフェクション実験を行い、それぞれのトランスフェクションにおける最高の条件を決定することを推奨します。
  5. 最適化された試薬を用いてsiRNAを導入する　目的の細胞タイプに最適なsiRNAトランスフェクション試薬およびプロトコールを使用します。siRNA実験を成功させるためには、トランスフェクション試薬の選択が重要です。small RNAの導入用として処方されているトランスフェクション試薬を使用することは必要不可欠です（市販されているトランスフェクション試薬の大部分は、小さいRNA分子用ではなく大きいプラスミドDNA用としてデザインされています）。また、特定の細胞系のトランスフェクション用に開発された試薬がある一方、幅広い特異性を持つ試薬もあります。
  6. トランスフェクションおよびアッセイ条件を最適化するために適切なポジティブコントロールを使用する　ハウスキーピング遺伝子は、ほとんどの細胞タイプに適したポジティブコントロールです。条件を最適化するためには、選択したポジティブコントロールに特異的なsiRNAおよび実験に用いるターゲットsiRNAをいくつかの濃度でターゲット細胞にトランスフェクションします。トランスフェクション48時間後に、非導入細胞と比較したコントロールタンパク質またはmRNAレベルの低下を測定します。siRNA濃度が高過ぎると細胞毒性や細胞死につながります。最大の利便性が得られるように、弊社では、様々な遺伝子ターゲットに対するポジティブコントロールを提供しています。
  7. 非特異的効果を区別するために、siRNAネガティブコントロールを使用する　ネガティブコントロールは、大部分の活性siRNAのヌクレオチド配列をスクランブルすることによりデザインする必要があります。しかしながら、必ず相同性検索を行い、ネガティブコントロール配列が研究対象の生物種のゲノムと相同性を持たないことを確認します。
  8. 標識siRNAを使用することによるプロトコールの最適化　蛍光標識siRNAを使用することにより、siRNAの安定性およびトランスフェクション効率を解析できます。標識siRNAは、siRNAの細胞内局在性に関する研究や二重標識実験（標識抗体との）においても有用で、トランスフェクションの間にsiRNAを受け取った細胞を可視化し、トランスフェクションと標的タンパク質のダウンレギュレーションを関連付けできます。

siRNAトランスフェクションの最適化

siRNAトランスフェクション効率に影響する要素

細胞毒性を最小限に抑えながら最高のトランスフェクション効率を得ることは、遺伝子サイレンシングを最適化するのに必要不可欠です。siRNA誘導性ノックダウンと細胞生存率のバランシングに似た、siRNA導入と下流の表現型アッセイ条件の間にもバランシングが存在します。siRNAスクリーニングパスにおいて用いられる様々なダウンストリームアッセイごとに、siRNAの導入条件を再最適化することが必要と考えられます。下記の要素（重要性の高い順）を確認することにより、各細胞タイプでの最高のトランスフェクション効率が達成されます。

  1. トランスフェクション試薬の選択
  2. トランスフェクション試薬の量
  3. siRNAの量
  4. トランスフェクション時の細胞密度
  5. 細胞のトランスフェクション試薬/siRNA複合体への曝露時間
  6. トランスフェクション法： 細胞をプレーティングしてからトランスフェクションする従来の方法またはトランスフェクション試薬を接着させたプレートにおいて細胞にトランスフェクションさせるリバーストランスフェクション法
  7. 血清の有無: 最高の遺伝子サイレンシング条件が決定したら、特定の細胞タイプを使用する実験間で条件を一定に保ちます。

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