Analyseurs génétiques SeqStudio Flex

Amplification of DNA sequences by polymerase chain reaction (PCR) remains the workhorse for almost all aspects of molecular biology and genomic research.  There is an increasing need to analyze many targets in a single sample.  However, this can be tedious by PCR, involving setting up individual reactions for each of the desired targets.  Methods that can analyze multiple sequences from a single sample would simplify workflows and conserve precious samples.  One method to address this is fragment analysis by capillary electrophoresis (CE).  CE separates amplicons based on both size and fluor in a single capillary allowing a very large number of targets to be analyzed within a single sample.  

Multiplexed PCR coupled with fragment analysis presents a tremendous opportunity to perform complex analyses with minimal expense or effort.  Experiments are limited only by the ability to design primer sets against the targets of interest.  It can therefore be adapted and utilized in nearly any scenario where detection of many target sequences in a single sample is desired.  

This example demonstrates the power of multiplexed PCR by fragment analysis using a custom panel for detecting respiratory viral pathogens.  A panel of PCR primers containing 6-FAM labeling at the 5’-end were designed to detect 12 different respiratory RNA viruses, including rhinovirus, RSV-B, influenza A H1, influenza A H3, influenza B, coronavirus HKU1, coronavirus NL63, coronavirus OC43, and coronavirus 229E, as well as SARS-CoV-2 S, N, and orf1ab, so that each organism generated a different sized amplicon.  The resulting amplicons could be separated and examined using the SeqStudio, SeqStudio 24 Flex, or 3500xL genetic analyzers.

Il est souvent nécessaire d’effectuer un contrôle qualité (CQ) sur un pool de départ d’ADN double brin (ADNdb) avant de lancer une analyse génomique ou de passer à l’étape suivante. Par exemple, l’ADN extrait de tissu préservé de FFPE peut être fragmenté et trop petit pour fournir des informations utiles, de sorte qu’il est utile de connaître la taille globale avant de continuer.

La taille et l’abondance relative des fragments d’ADNdb peuvent être analysées sur les analyseurs génétiques de la série SeqStudio Flex. Dans le protocole, le TOTO-1, un fluorophore intercalant de l’ADN, est incubé avec un échantillon, qui passe par le polymère POP7 lorsque le dispositif de chauffage de capillaires est éteint. (Cela maintient l’ADN en grande partie dans un état non dénaturé à double brin.) En comparant la migration résultante des fragments de test avec la migration des étalons d’ADNdb connus, la taille des fragments de test peut être déterminée.

Dans ce test, nous avons évalué les performances de l’analyseur génétique SeqStudio Flex ainsi que de l’analyseur génétique 3500xL dans l’analyse de plusieurs types d’échantillons d’ADN, y compris deux étalons d’ADNdb connus illustrés dans la figure. Le panneau A illustre une analyse d’ADN de phage lambda digéré avec HindIII, montrant le motif familier de huit fragments allant de 23 130 à 125 bp. Le panneau B montre un mélange des mêmes digestes lambda HindIII avec le phage phiX174 digéré avec BsuRI. En plus des huit fragments de lambda, dix autres fragments allant de 1 353 à 72 bp ont été détectés. Les profils obtenus sur les instruments SeqStudio Flex (à gauche) et 3500xL (à droite) étaient assez similaires, validant ainsi l’instrument le plus récent par rapport à la série 3500.

Certaines recherches nécessitent des informations de séquence ciblées pour une région spécifique d’un génome. Bien que les outils de découverte à l’échelle du génome tels que le NGS fournissent de vastes quantités de données sur de très grandes régions, de telles approches complexes ne sont pas toujours nécessaires dans la recherche ciblée. Le séquençage de Sanger offre une solution simple, économique et facile à interpréter pour un séquençage de référence d’une région génomique. 

Pour démontrer un séquençage ciblé, nous avons séquencé la région du génome du SARS-CoV-2 qui englobe la protéine Spike et les séquences adjacentes, en nous appuyant sur des recherches antérieures identifiant 12 paires d’amorces de séquençage pour l’ensemble du gène du Spike du SARS-CoV-2. La région du gène du Spike du SARS-CoV-2 couverte par les 12 amplicons qui se chevauchent s’étend sur 5 kb.

Dans le panneau A de la figure, des résultats de séquençage de Sanger de haute qualité (indiqués par la hauteur des barres bleu clair) ont été obtenus à partir de presque tous les 12 amplicons dans les deux directions, comme illustré dans la figure.

Ces résultats ont été assemblés en une même lecture contig du gène du Spike du SARS-CoV-2. Les paramètres de qualité de la lecture étaient presque identiques sur les trois analyseurs. La qualité constante de la désignation de base, telle que démontrée ici, permet au séquençage de Sanger d’assembler la séquence de régions ciblées à l’aide d’amplicons de mi-longueur qui se chevauchent, générant ainsi des contigs qui couvrent un locus d’intérêt.