SeqStudio Flex Genetic Analyzer

Amplification of DNA sequences by polymerase chain reaction (PCR) remains the workhorse for almost all aspects of molecular biology and genomic research.  There is an increasing need to analyze many targets in a single sample.  However, this can be tedious by PCR, involving setting up individual reactions for each of the desired targets.  Methods that can analyze multiple sequences from a single sample would simplify workflows and conserve precious samples.  One method to address this is fragment analysis by capillary electrophoresis (CE).  CE separates amplicons based on both size and fluor in a single capillary allowing a very large number of targets to be analyzed within a single sample.  

Multiplexed PCR coupled with fragment analysis presents a tremendous opportunity to perform complex analyses with minimal expense or effort.  Experiments are limited only by the ability to design primer sets against the targets of interest.  It can therefore be adapted and utilized in nearly any scenario where detection of many target sequences in a single sample is desired.  

This example demonstrates the power of multiplexed PCR by fragment analysis using a custom panel for detecting respiratory viral pathogens.  A panel of PCR primers containing 6-FAM labeling at the 5’-end were designed to detect 12 different respiratory RNA viruses, including rhinovirus, RSV-B, influenza A H1, influenza A H3, influenza B, coronavirus HKU1, coronavirus NL63, coronavirus OC43, and coronavirus 229E, as well as SARS-CoV-2 S, N, and orf1ab, so that each organism generated a different sized amplicon.  The resulting amplicons could be separated and examined using the SeqStudio, SeqStudio 24 Flex, or 3500xL genetic analyzers.

Häufig ist es erforderlich, eine Qualitätskontrolle (QK) an einem Anfangspool doppelsträngiger DNA (dsDNA) durchzuführen, bevor die genomische Analyse eingeleitet oder mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Beispielsweise kann die aus FFPE-konserviertem Gewebe extrahierte DNA fragmentiert und zu klein sein, um nützliche Informationen zu liefern. Daher ist es nützlich, die Gesamtgröße zu kennen, bevor Sie fortfahren.

Die Größe und relative Häufigkeit von dsDNA-Fragmenten kann unter Verwendung der SeqStudio Flex Series Genetic Analyzer analysiert werden. Im Protokoll wird TOTO-1, ein fluoreszierender DNA-Interkalationsfarbstoff, mit einer Probe inkubiert, die bei ausgeschalteter Kapillarheizung durch POP7 Polymer geleitet wird. (Dadurch wird die DNA in einem weitgehend doppelsträngigen, nicht denaturierten Zustand erhalten.) Durch den Vergleich der resultierenden Migration der Testfragmente mit der Migration bekannter dsDNA-Standards kann die Größe der Testfragmente bestimmt werden.

In diesem Test haben wir die Leistung des SeqStudio Flex Genetic Analyzers sowie des 3500xL Genetic Analyzers bei der Analyse mehrerer Arten von DNA-Proben, einschließlich zweier bekannter dsDNA-Standards, die in der Abbildung dargestellt sind, bewertet. Im Panel A ist eine Analyse der Phage-Lambda-DNA mit HindIII-Verdau dargestellt, die das bekannte Muster von acht Fragmenten von 23.130 bis 125 bp aufweist. Panel B zeigt eine Mischung aus den gleichen Lambda-HindIII-Verdaus mit Phage PhiX174, die einem BsuRI-Verdau unterzogen wurde. Neben den acht Lambda-Fragmenten wurden zehn weitere Fragmente im Bereich von 1.353 bis 72 bp nachgewiesen. Die Profile, die auf den SeqStudio Flex (links) und 3500xL (rechts) Geräten erstellt wurden, waren einander ziemlich ähnlich, was das neuere Gerät im direkten Vergleich zu der 3500 Serie validiert.

Einige Untersuchungen erfordern gezielte Sequenzinformationen für einen bestimmten Bereich eines Genoms. Während Hilfsmittel für genomweite Entdeckungen, wie z. B. NGS, große Datenmengen über sehr große Bereiche liefern, sind solche komplexen Ansätze nicht immer für die gezielte Forschung erforderlich. Die Sanger-Sequenzierung bietet eine simple, kostengünstige und einfach zu interpretierende Lösung für die Goldstandardsequenzierung eines Genombereichs. 

Um eine fokussierte Sequenzierung zu demonstrieren, haben wir den Bereich des SARS-CoV-2-Genoms, der das Spike-Protein und benachbarte Sequenzen umfasst, sequenziert. Dabei haben wir uns auf frühere Forschungsarbeiten gestützt, in denen 12 Paare von Sequenzierungsprimern für das gesamte SARS-CoV-2-Spike-Gen identifiziert wurden. Der Spike-Genbereich des SARS-CoV-2, der von den 12 überlappenden Amplikonen abgedeckt wird, erstreckt sich über 5 kb.

Wie im Panel A der Abbildung dargestellt, wurden aus fast allen 12 Amplikonen in beide Richtungen hochwertige Sanger-Sequenzierungsergebnisse (angezeigt durch die Höhe der hellblauen Balken) gewonnen.

Diese Ergebnisse wurden zu einem einzigen zusammenhängenden Read (Contig Read) des SARS-CoV-2 Spike-Gens zusammengefügt. Die Read-Qualität war bei allen drei Sequenzierern nahezu identisch. Wie hier gezeigt, ermöglicht die konsistente Qualität der Basenerkennung bei der Sanger-Sequenzierung, mithilfe überlappender Amplikone mittlerer Länge die Sequenz fokussierter Bereiche zusammenzufügen, wodurch zusammenhängende Reads (Contigs) erzeugt werden, die einen interessierenden Bereich abdecken.