Protokoll für den ViewRNA Gewebefluoreszenz-Assay

• Die Inkubationszeiten und Temperaturen sollten strikt befolgt werden, um eine erfolgreiche Hybridisierung zu gewährleisten.
• Alle Schritte, bei denen RNase-freies Wasser verwendet wird, sollten mit Nuklease-freien Laborartikeln und Einwegpipettenspitzen durchgeführt werden, um RNase-Kontamination zu vermeiden.
• Für das Hybridisierungssystem wird ein Inkubator für humifizierte Gewebekultur nicht für dieses Protokoll empfohlen.
• Bei allen Waschschritten 200 ml der angegebenen Waschlösung verwenden und gute Waschtechnik verwenden. Ziehen Sie die Objektträger während der Waschvorgänge vorsichtig vor, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und trocknen Sie die Probe nicht vollständig aus.
• Vorwärmen der Verdünnungsreagenzien auf 40 °C, bevor sie mit dem Protokoll beginnen. Aufgrund der viskosen Eigenschaften von Verdünnungsreagenzien wird empfohlen, keine Aliquote zu bilden, die gesamte Flasche auf 40 °C zu erwärmen und die Flüssigkeit nach Bedarf zu entfernen.
• Es gibt einen optionalen Schritt zur Aufbewahrung über Nacht.

Wir empfehlen, in jedem Assay positive und negative Kontrollen einzubeziehen, um Ihre Ergebnisse zu qualifizieren und zu interpretieren.

Beispiele für Negativkontrollen

• Lassen Sie das Zielsondenset weg
• Verwenden Sie ein Sondenset, das auf den Sense-Strang des Ziels ausgelegt ist
• Verwenden Sie ein Sondenset für ein Ziel, das nicht in Ihrer Gewebeprobe vorhanden ist

Beispiele für Positivkontrollen

• Housekeeping-Gene: ACTB, GAPDH oder UBC (weitere Informationen zur Auswahl der Kontrollsonden finden Sie im Benutzerhandbuch auf Seite 13)

Kalibrieren Sie die Temperatur des Trockenschranks mit dem ViewRNA Kit zur Validierung der Temperatur auf 40 °C. Bei Verwendung des Trockenschranks und der Befeuchtungskammer, wie z. B. dem StainTray-Objektträgerhalter, muss der entsprechende Wasserstand erreicht werden. Der StainTray-Objektträgerhalter kann durch eine geschlossene Kunststoffkammer ersetzt werden, die mit einem benetzten Gewebepapier und einer erhöhten Plattform geliefert wird, um eine Hybridisierungskammer zu erzeugen.

Hinweis: In diesem Protokoll können FFPE- und kryokonservierte Gewebe verwendet werden. Die Schritte der Gewebevorbereitung unterscheiden sich je nach Probe. Fahren Sie mit dem entsprechenden Abschnitt fort, um Ihr Gewebe vorzubereiten.

FFPE-Gewebevorbereitung

Objektträger backen (optional)

Das Backen von Gewebeproben bei 60 °C für 1 Stunde kann die Gewebehaftung an den Probenobjektträgern fördern. Wenn Sie Ihre eigene FFPE-Probe erstellen, ist dieser Schritt möglicherweise erforderlich. Wenn Sie FFPE-Proben kaufen, wenden Sie sich bitte an den Anbieter, um zu erfahren, ob der Backschritt bereits durchgeführt wurde.

Objektträger entparaffinieren

1. Entparaffinieren Sie mit Xylol, und rehydrieren Sie diese mit Ethanol gemäß den Standardprotokollen

Wärmevorbehandlung durchführen

1. Decken Sie 1x Becher mit Vorbehandlungslösung fest mit Aluminiumfolie ab und stellen Sie diesen auf eine Heizplatte. Auf 90 bis 95 °C erhitzen.
2. Legen Sie die Objektträger in ein vertikales Objektträgerhaltergestell und tauchen Sie sie mit der Pinzette in die erhitzte 1x Vorbehandlungslösung ein. Decken Sie den Glasbecher mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie sie bei 90 bis 95 °C für die optimale Dauer.
   (Hinweis: Die Richtlinien finden Sie im Benutzerhandbuch auf Seite 29 „Verfahren zur Optimierung der Vorbehandlung“).
3. Das Objektträgergestell mit der Pinzette entfernen und die Objektträger in dd H₂O in eine Färbeschale mit 200 ml dd H₂O. eintauchen: 1 Minute lang bei häufigem Schütteln waschen.
4. Dekantieren und den Waschvorgang mit 200 ml frischem dd H₂O wiederholen.
5. Transferieren Sie das Objektträgergestell in eine Färbeschale mit 1x PBS. Fahren Sie mit dem Abschnitt „Hydrophobe Barriere zeichnen“ fort.
   Hinweis: Lassen Sie die Gewebeschnitte nicht von diesem Punkt nach vorne austrocknen. Nach einer Wärmevorbehandlung können die Schnitte über Nacht bei Raumtemperatur in 1x PBS abgedeckt gelagert werden.

Objektträger lagern (optional)

1. Nach der Wärmevorbehandlung können Objektträger über Nacht gelagert werden. Lagern Sie Objektträger in einer klaren Färbeschale mit 200 ml Lagerpuffer bei Raumtemperatur bis zu 24 Stunden lang. Decken Sie die Schale mit einem Deckel oder einer Dichtungsfolie ab, um Verdunstung zu verhindern.

Kryokonservierte Gewebevorbereitung

Zusammeneingebettetes Gewebe vorbereiten

1. Fügen Sie Gewebeschnitte zu vorgekühltem 4 % Formaldehyd (Image-iT Fixierlösung) hinzu und fixieren Sie sie über Nacht (16 bis 19 Stunden) bei 4 °C.
2. Waschen Sie die Objektträger 1 Minute lang mit 200 ml 1x PBS. Fahren Sie mit dem Abschnitt „Hydrophobe Barriere zeichnen“ fort.

Objektträger lagern (optional)

1. Nach der Fixierung können Objektträger über Nacht gelagert werden. Lagern Sie Objektträger in einer klaren Färbeschale mit 200 ml Lagerpuffer bei Raumtemperatur bis zu 24 Stunden lang. Decken Sie die Schale mit einem Deckel oder einer Dichtungsfolie ab, um Verdunstung zu verhindern.

Hydrophobe Barriere ziehen

1. Verwenden Sie einen Pap Pen, um eine wasserabweisende Barriere um den Gewebeschnitt zu ziehen. Die Barriere 2 bis 4 Mal leicht nachverfolgen. Decken Sie das Gewebe mit 100 bis 200 µl 1x PBS ab, genug, um die Probe vollständig abzudecken, ohne die hydrophobe Barriere zu berühren, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht austrocknet.
2. Die Barriere 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.
3. Weiter zum Abschnitt „Protease-Verdau and -Fixierung“.

Protease-Verdau und -Fixierung

Hinweis: Stellen Sie vor Beginn dieses Verfahrens sicher, dass 1x PBS auf 40 °C vorgewärmt ist.

1. Bereiten Sie die Arbeitsproteaselösung vor, indem Sie die Proteaselösung 1:100 in vorgewärmtem 1x PBS verdünnen und kurz vortexen.
2. Nehmen Sie jeden Objektträger aus dem Gestell, und schwenken Sie ihn, um überschüssiges 1x PBS zu entfernen.
3. Legen Sie die Objektträger mit der Vorderseite nach oben in die Kammer zur Färbung von Objektträgern, und geben Sie sofort 400 µl der Arbeitsproteaselösung in den Gewebeschnitt, um sicherzustellen, dass der Gewebeschnitt abgedeckt ist.
4. Bringen Sie Objektträger in den Trockenschrank und inkubieren Sie sie bei 40 °C für die optimale Dauer.
   Weitere Informationen zum Gewebetyp und zur optimalen Inkubationszeit finden Sie im Benutzerhandbuch.
5. Die Arbeitsproteaselösung von den Objektträgern dekantieren, die Objektträger in 200 ml 1x-PBS-Färbeschale waschen und 1 Minute lang sanft schwenken. Den Waschvorgang noch 1 Mal mit frischem 1x PBS wiederholen.
6. Das Objektträgergestell in eine Färbeschale mit 200 ml Fixierlösung geben und 5 Minuten bei Raumtemperatur unter Abzug fixieren.
7. Waschen Sie die Objektträger 1 Minute lang mit 200 ml frischem 1x PBS unter häufigem Schwenken.

Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das Verdünnungsmittel für Sondensets vor Beginn dieses Verfahrens auf 40 °C vorgewärmt ist. Bereiten Sie ausreichend Volumen vor, um 400 µl pro Probe zuzugeben.

1. Bereiten Sie die Arbeitslösung für Sondensets vor, indem Sie die ViewRNA Sondensets 1:40 in vorgewärmtem Verdünnungsmittel für Sondensets verdünnen. Verdünnen Sie 10 µl von jedem Zielsondenset im vorgewärmten Verdünnungsmittel für Sondensets auf ein Gesamtvolumen von 400 µl pro Objektträger. Kurz vortexen und 400 µl pro Objektträger hinzugeben. Empfohlene Verdünnungen für 1- bis 4-Plex-Assays finden Sie in Tabelle 3 im Anhang.
   Hinweis: Für Ziele mit geringer Abundanz verdünnen Sie die Zielsonde(n) 1:20 oder 1:30. Nehmen Sie jeden Objektträger aus dem Gestell, und schwenken Sie ihn, um überschüssiges 1x PBS zu entfernen.
2. Zur Negativkontrolle bis zu 400 µl des vorgewärmten Verdünnungsmittels für Sondensets hinzufügen und bis zu 400 µl der Arbeitslösung für Sondensets zu jeder Testprobe.
3. Geben Sie die Objektträger in den Trockenschrank und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei 40 °C.
4. Die Arbeitslösung für Sondensets von den Objektträgern dekantieren und die Objektträger in ein Objektträgergestell mit Waschpuffer eintauchen.
5. Die Objektträger 3 Mal mit frischem 200 ml Waschpuffer bei Raumtemperatur für 2 Minuten bei konstanter Bewegung waschen.
6. Fahren Sie mit „Objektträger lagern“ fort, wenn Sie den Assay über zwei Tage durchführen möchten, andernfalls fahren Sie mit „Signalverstärkung und Signalerkennung“ fort.

Objektträger lagern (optional)

1. Lagern Sie Objektträger in einer klaren Färbeschale mit 200 ml Lagerpuffer bei Raumtemperatur bis zu 24 Stunden lang. Decken Sie die Schale mit einem Deckel oder einer Dichtungsfolie ab, um Verdunstung zu verhindern.

Waschen Sie die gelagerten Objektträger (für eintägiges Protokoll überspringen)

Hinweis: Bevor Sie mit diesem Schritt beginnen, stellen Sie sicher, dass die Reagenzien für die Amplifikation und Detektion auf 40 °C erwärmt wurden.

1. Aus Speicherpuffer entfernen. Transferieren Sie das Gestell in eine durchsichtige Färbeschale mit Waschpuffer, und waschen Sie es 2 Minuten lang bei häufigem Schütteln.
2. Dekantieren Sie den Waschpuffer und waschen Sie erneut mit 200 ml frischem Waschpuffer für 2 Minuten bei häufiger Bewegung. Den Waschschritt 1 Mal mit frischem Waschpuffer wiederholen.

Signalamplifikation durchführen

Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das Verdünnungsmittel für Verstärker QF auf 40 °C erwärmt wird, bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen.

1. Bereiten Sie die Mischlösung des Vorverstärkers vor, indem Sie sie mischen und dann 1:25 in vorgewärmtem Verdünnungsmittel für Verstärker QF verdünnen.
2. Entfernen Sie die Objektträger, und schwenken Sie sie, um den Waschpuffer zu entfernen. Legen Sie die Objektträger mit der Vorderseite nach oben auf die Objektträger-Färbekammer, und fügen Sie sofort 400 µl der Arbeitsmischung des Vorverstärkers in den Gewebeschnitt ein, um sicherzustellen, dass der Gewebeschnitt abgedeckt ist.
3. Transferieren Sie die Objektträger in das Hybridisierungssystem und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 40 °C.
4. Setzen Sie ein leeres Objektträgergestell in eine klare Färbeschale mit 200 ml Waschpuffer ein.
5. Dekantieren Sie die Vorverstärkermischung von den Objektträgern und setzen Sie sie in das Objektträgergestell im Waschpuffer ein.
6. Waschen Sie die Objektträger 2 Minuten lang bei Raumtemperatur bei konstantem Schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt mit frischem Waschpuffer für insgesamt 3 Waschvorgänge.
7. Bereiten Sie die Mischlösung des Arbeitsverstärkers vor, indem Sie kurz 1:25 in vorgewärmtem Verdünnungsmittel für Verstärker QF schwenken und verdünnen.
8. Entfernen Sie die Objektträger, und schwenken Sie sie, um den Waschpuffer zu entfernen. Legen Sie die Objektträger mit der Vorderseite nach oben auf die Objektträger-Färbekammer, und fügen Sie sofort bis zu 400 µl der Verstärkermischung in den Gewebeschnitt ein, um sicherzustellen, dass der Gewebeschnitt abgedeckt ist.
9. Transferieren Sie die Objektträger in das Hybridisierungssystem und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 40 °C.
10. Setzen Sie ein leeres Objektträgergestell in eine klare Färbeschale mit 200 ml Waschpuffer ein.
11. Dekantieren Sie die Verstärkermischung von den Objektträgern und setzen Sie sie in das Objektträgergestell im Waschpuffer ein.
12. Waschen Sie die Objektträger 2 Minuten lang bei Raumtemperatur bei konstantem Schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt mit frischem Waschpuffer für insgesamt 3 Waschvorgänge.

Hybridisierung der Markierungssonde durchführen

Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Verdünnungsmittel für Markierungssonden QF auf 40 °C vorgewärmt ist, bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen.

1. Bereiten Sie die Arbeitsmischlösung für Markierungssonden durch kurzes Schwenken und Verdünnen der Markierungssonden 1:25 in vorgewärmten Verdünnungsmittel für Markierungssonden QF. Verdünnen Sie 16 µl jeder Markierungssonde im vorgewärmten Verdünnungsmittel für Markierungssonden, um ein Gesamtvolumen von 400 µl pro Objektträger zu erreichen. Zum Mischen kurz vortexen. Verdünnungsvorschläge für 1- bis 4-Plex-Assays finden Sie in Tabelle 4 im Anhang.
2. Kurz vortexen, um sie vor Licht zu schützen.
3. Entfernen Sie die Objektträger, und schwenken Sie sie, um den Waschpuffer zu entfernen. Legen Sie die Objektträger mit der Vorderseite nach oben auf die Objektträger-Färbekammer, und geben Sie sofort 400 µl der vorgewärmten Arbeitsmischung für Markierungsonden auf den Gewebeschnitt, um sicherzustellen, dass der Gewebeschnitt abgedeckt ist.
4. Geben Sie die Objektträger in das Hybridisierungssystem und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 40 °C.
5. Setzen Sie ein leeres Objektträgergestell in eine klare Färbeschale mit 200 ml Waschpuffer ein.
6. Dekantieren Sie die Markierungssondenmischung von den Objektträgern und setzen Sie sie in das Objektträgergestell im Waschpuffer ein.
7. Waschen Sie die Objektträger 2 Minuten lang bei Raumtemperatur bei konstantem Schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt mit frischem Waschpuffer.
8. Führen Sie bei häufigem Schütteln eine abschließende Waschung mit Waschpuffer 10 Minuten lang durch. Nicht länger als 30 Minuten waschen.
9. Fahren Sie mit „Gegenfärbung und Montage für die Erkennung“ fort.

(Optional): Autofluoreszenz von Geweben verringern

1. Entfernen Sie die Objektträger aus dem Waschpuffer, und schwenken Sie sie, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen.
2. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal mit frischem 1x PBS 3 Minuten lang bei Raumtemperatur und häufigem Schütteln.
3. Bereiten Sie das ReadyProbes Gewebeautofluoreszenz Quenching Kit vor, indem Sie gleiche Volumina der Komponenten A, B und C kombinieren.
4. 400 µl der vorbereiteten ReadyProbes Lösung zu jeder Probe geben und dann 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal mit frischem 1x PBS 3 Minuten lang bei Raumtemperatur und häufigem Schütteln.
6. Fahren Sie mit „Gegenfärbung und Eindeckmittel für den Nachweis“ fort.

Gegenfärbung und Eindeckmittel für den Nachweis

Hinweis: Für den ViewRNA Gewebefluoreszenz-Assay werden Eindeckmittel mit Antifade dringend empfohlen.

1. Das Gewebe mit DAPI unter Verwendung von Standardprotokollengegenfärben.
2. Montieren Sie die Deckgläser mit einem Antifade-Eindeckmittel. Das ProLong Glass Reagenz wird für das härtende Eindecken und die Langzeitarchivierung von Gewebeproben empfohlen. Das SlowFade Glass Reagenz wird für das nicht härtende Eindecken empfohlen, wenn das Deckglas entfernt werden muss.
   Hinweis: Für optimale Ergebnisse die Anweisungen mit dem Eindeckreagenz befolgen.
3. Analysieren Sie das Gewebe mit einem kompatiblen Bildgebungssystem wie einem invertierten Fluoreszenzmikroskop oder einer HCS-Plattform.

Tabelle 1. Bezeichnung der Typen von Fluoreszenzsondensets.
Spektrale Eigenschaften dieser Fluorophore sind in unseren Online-Auswahlhilfen für Fluorophorezu finden.

Tabelle 2. ViewRNA Gewebefluoreszenz-Kit und Moduloptionen.

Tabelle 3. Beispiele für Verdünnungen von Zielsondensets.

Tabelle 4. Empfohlene Verdünnungen von Markierungssonden.