Uracil-DNA-Glykosylase, hitzelabil

Uracil-DNA Glycosylase entfernt Uracil aus dU-haltiger DNA, indem die N-Glykosidbindung zwischen der Uracil-Basis und der Zuckerstruktur gespalten wird. Diese Spaltung erzeugt alkaliempfindliche apyrimidinische Stellen, die durch DNA-Polymerase an der Replikation gehindert oder daran gehindert werden, zu einer Hybridisierungsstelle zu werden.

Doppel- und einzelsträngige dU-haltige DNA sind Substrate für Uracil-DNA-Glykosylase, was aber nicht auf RNA und normale dT-haltige DNA zutrifft.

Uracil-DNA-Glykosylase kann auch verwendet werden, um die Klonierungseffizienz von PCR-Produkten zu erhöhen, in die dU-haltige Primer integriert sind, und die Effizienz der ortsspezifischen Mutagenese zu erhöhen.

Die aus Gadus Morhua abgeleitete Uracil-DNA-Glykosylase weist alle Eigenschaften des Enzyms auf, das aus E. coli abgeleitet wurde, mit dem zusätzlichen Vorteil, hitzelabile Eigenschaften zu haben. Nach 10-minütiger Inkubation bei 50°C ist es vollständig und irreversibel inaktiviert.

Reinheit:
Das Enzym wird chromatographisch gereinigt und auf kontaminierende Endonukleasen und Exonukleasen getestet.

Lagerpuffer:
50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 % Triton X-100, 50 % Glycerin.

Assay-Bedingungen:
Das Reaktionsgemisch enthält 70 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 µg/ml BSA, ³H-dUTP markierte DNA und Uracil-DNA-Glykosylase. Die Inkubation dauert 1 Stunde bei 37°C.

Definition der Einheit:
Eine Einheit ist die Enzymmenge, die erforderlich ist, um 1 nmol Uracil aus dU-haltiger DNA in einer Stunde bei 37°C freizusetzen.

Konzentration:
1 Einheit/µl

Anwendungen:
  1.Untersuchung der DNA-Reparatur und des Mutationsnachweises.
  2.Steigerung der Klonierungseffizienz von PCR-Produkten.
  3.Steigerung der Effizienz der ortsspezifischen Mutagenese.
  4.Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen.

Quelle:
Rekombinant aus Gadus morhua (Kabeljauleber)