Active Rho Pull-Down and Detection Kit

Thermo Scientific Pierce活性型Rhoプルダウンおよび検出キットは、Rhotekinタンパク質結合ドメインとの特異的なタンパク質相互作用により、GTP結合Rho GTPaseの選択的濃縮と検出を可能にします。

活性型Rhoプルダウンおよび検出キットには、精製したGST-Rhotekin Rho結合ドメイン（RBD）、グルタチオンアガロースレジン、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロール（それぞれGTPγSおよびGDP）、溶解／結合／洗浄バッファー、抗Rho抗体、二次抗体、サンプルバッファー、スピンカラム、および収集チューブが付属しています。このキットは、堅牢なRho活性を持つことが知られている細胞株、NIH 3T3細胞のライセートを使用して検証されています。

活性型Rhoプルダウンおよび検出キットの特長：

•高感度かつ高精度 — 最適化された試薬、特異的汎抗Rho抗体、およびウェスタンブロット法により、正確なコントロールと定量結果を保証
• 検証済み — 検査済みのRho検出機能で品質と性能を保証
• 適合性 — マウス、ラット、およびヒト由来のさまざまな細胞タイプに対応

アプリケーション：
• 細胞の分化、移動、分裂、細胞骨格の再配列中のRho GTPaseの活性化の追跡
• 張力線維形成中のRhoの活性化の研究
• 増殖因子による刺激後のRho活性のモニタリング
• 小分子阻害剤のRho活性への影響のスクリーニング

活性型Rhoプルダウンおよび検出キットは、GTPγSで処理した細胞溶解物を使用して内因性Rhoを活性化し、GDP処理ライセートと比較して低分子量GTPaseを不活性化することにより、活性型Rhoの機能と特異性を検証しています。GTPγS処理は、GTP結合型（活性）でRhoをトラップし、内在性Rhoが存在する場合に強いシグナルを発生させます。GDP処理は、RhoをGDP結合状態（非活性）に押し上げるため、Rhoのタンパク質レベルに関係なくシグナルがほとんどまたは全く得られません。このキットは、HRP標識二次抗体（キットに付属）とThermo Scientific SuperSignal West Pico化学発光基質（別売、製品番号34080）を使用したウェスタンブロット検出用に最適化されています。キットには、30回のプルダウンアッセイに十分なコンポーネントが含まれています。

キットのコンポーネントは、免疫蛍光染色にも使用できます。神経NS-1細胞をNGFで刺激し、キットに含まれるGST-RBDタンパク質と抗Rho抗体を使用して活性型Rhoの空間分布を調べました。

Rhoバックグラウンド：
RhoファミリーのGTPaseは、細胞シグナル伝達、転写調節、アクチン細胞骨格の構成など、多くの細胞機能を提供します。このGTPaseファミリーには、Rho（RhoA、RhoB、RhoC）、Rac（Rac1、Rac2、Rac3、RhoG）、Cdc42（Cdc42およびG25K）、Rnd（Rnd1、Rnd2、およびRhoE/Rnd3）、RhoBTBファミリー、およびMiroファミリーが含まれます。これらのGTPaseは、GPCR、チロシンキナーゼ、サイトカイン、および接着受容体を介して、血漿膜からサイトゾルへのシグナル伝達を可能にします。血漿膜への接着は、タンパク質のカルボキシ末端にあるゲラニルゲラニル脂質修飾により達成されます。Rho GTPaseによるシグナル伝達で、アクチンが張力線維に再編成され、接着斑が形成されます。RhoAはサイトゾルと血漿膜に局在し、RhoBは血漿膜と膜小胞に局在します。RhoCはRhoAと同様に細胞質性ですが、不核領域に局在します。

Rho GTPaseは、GEF、GAP、GDIおよびエフェクタータンパク質と相互作用して、シグナル伝達します。Rho GTPaseには30を超える哺乳類GEFが存在し、各GEFにはヌクレオチド交換反応に対応するDBL相同ドメイン、プレクストリン相同ドメイン、およびタンパク質間相互作用に対応する追加特異ドメインが含まれています。Rho GAPタンパク質はGTPの加水分解を加速し、GDIタンパク質は細胞質と膜の間でRho GTPaseの転座を可能にし、Rho GEFによるGPD/GTP交換を阻害します。GPCRによるシグナル伝達には、RhoおよびGαサブユニットとのGEFおよびGDIの相互作用が必要です。一部のエフェクタータンパク質には、ストレス繊維形成に関与するセリン／スレオニンキナーゼであるp160 Rhoキナーゼ、アクチン細胞骨格の再編成を引き起こすp140mDia、およびNF-κBを活性化するためのシグナル伝達を媒介するセリン／スレオニンキナーゼ足場タンパク質であるRhotekinを含みます。RhoファミリーGTPaseは、細胞シグナル伝達中にはアゴニスト的に作用し、分化中にはアンタゴニスト的に作用します。

詳細な製品データ
• 特定の下流エフェクターを介した低分子量GTPaseの活性化の測定
• 神経細胞分化における活性GTPaseの検出と局在化の測定