EZ-Link™ NHS-Desthiobiotin

Thermo Scientific EZ-Link NHS-デスチオビオチンは、ストレプトアビジンからビオチン様基が溶出可能な短い膜透過性のアミン反応性ラベリング試薬で、細胞内タンパク質の標識や精製に適しています。

EZ-Link NHS-デスチオビオチンの特長：

•デスチオビオチン – ビオチンの類似体はストレプトアビジンからの溶出が容易で、アフィニティ精製に最適です
• タンパク質ラベリング – ストレプトアビジンビーズを用いたプルダウンアッセイでの高回収を可能にするために、精製サンプルまたは混合サンプル中の抗体またはタンパク質にタグを付けます
• 膜透過性 – 小さくて荷電していない試薬が細胞膜を越えて容易に拡散するため、無傷の細胞でも細胞内標識を行うことができます
• アミン反応性 – リジンの側鎖（K）やポリペプチドのアミノ末端などの第一級アミン（-NH2）と反応します

NHS-デスチオビオチンは、NHSエステルとして活性化され、タンパク質や他の分子の第一級アミン（-NH2）をデスチオビオチン基で共有結合的にラベリングするビオチンの一種です。このデスチオビオチンタグは、ストレプトアビジンやその他のビオチン結合タンパク質に高い特異性を持って結合するものの、穏やかな条件（すなわち、通常の遊離ビオチンとの競合的な置換）で容易に溶出します。このように、この試薬は、標識タンパク質の非変性溶出が望まれるアビジン-ビオチン法において、NHS-ビオチン（製品番号20217）に代わる有用な試薬です。この最もシンプルで最小のアミン反応性デスチオビオチン試薬は、無荷電で細胞膜透過性があります。そのため、NHS-デスチオビオチンは無傷の細胞を用いて細胞内タンパク質の標識に使用することができます。

デスチオビオチン対ビオチン
デスチオビオチンは、ビオチンのシングルリングで硫黄を含まない類似体で、ストレプトアビジンにほぼ同等の特異性で結合しますが、ビオチンよりも親和性が低いです（1/Kd = 10^11対10^15M、それぞれ）[1-2]。その結果、デスチオビオチン化ベイトタンパク質とその相互作用パートナーは、遊離ビオチンとの競合的な置換に基づいて、穏やかな条件でストレプトアビジンアフィニティー樹脂から簡単かつ特異的に溶出できます。また、生体サンプルを用いたプルダウンアッセイ実験では、デスチオビオチンのこうした穏やかな遊離特性により、遊離ビオチンを用いて標的タンパク質複合体を溶出した際に、ストレプトアビジンへの結合を維持した状態で、内因性ビオチン化分子の共精製を最小限に抑えることができます。また、修飾済みアビジン-ビオチンアフィニティーシステムにより、複合体の結合を解除したり、標的タンパク質や細胞を損傷したりする可能性のある厳しい溶出条件を用いる必要がなくなります。デスチオビオチンベースの手法は、融合タグで発現しない天然タンパク質や組換えタンパク質を使用する場合や、インタクトな細胞や細胞表面タンパク質を標的とするようなネイティブ条件下で捕捉タンパク質を分離する場合に最適です。

NHSエステル試薬による標識
ビオチンのN-ヒドロキシスルホスクシンイミド（NHS）エステル は、最も一般的なビオチン化試薬です。NHS活性化ビオチンは、アルカリ性バッファー中で１級アミノ基（-NH2）と効率的に反応して、安定したアミド結合を形成します。タンパク質は、典型的には、リジン（K）残基の側鎖および各ポリペプチドのN末端を含む、標識のための標的として利用可能ないくつかの一次アミンを有します。ほとんどのスルホ-NHSエステルは直接水溶性ですが、膜透過性はありません。プレーンNHSエステルは、水性バッファーへの溶解性は低いですが、膜透過性があります。