Pierce™ Direct IP Kit

Thermo Scientific Pierce Direct IPキットでは、活性化レジンを使用して、Protein A/Gの助けなしにIP抗体（あらゆる種およびサブクラス）をアガロースビーズ上に共有結合で固定化し、抗体干渉なしに免疫沈降を可能にします。

この方法の主な利点は、精製抗体のあらゆる種およびサブクラス（Protein AまたはGに結合する種類だけでなく）を使用できることと、抗体の混入なしに標的タンパク質を精製できることです。この方法では、標的以外の免疫グロブリンを共精製することなく、血清サンプルから抗原を免疫沈降することもできます。最後に、このキットではマイクロ遠心分離スピンカップを使用して、アガロースビーズレジンからサンプルを効果的に洗浄および分離します。

Direct IPキットの特長：

•必要な抗体は10 µg未満 — 手順の最適化により、1回のIP実験で必要な抗体は2～10 µgのみ、従来のIP法ではそれ以下
• 簡便かつ効率的なスケーラビリティ — 1回の免疫沈降に必要な抗体量のみを使用するか、または多くの実験にすぐに使用できるIPアフィニティレジンを調製するために100～200 µgの抗体を固定化
• 抗体の混入を最小化 — 精製タンパク質の重鎖と軽鎖の共溶出を最小限（5%未満）に抑えられるよう、抗体がアガロースビーズに不可逆的に結合
• 抗体のあらゆる種およびサブクラスを使用したIP — チキンIgY、ヒトIgE、マウスIgMなどのあらゆる精製タンパク質を使用可能
• 調製済み抗体アフィニティレジンを再使用可能 — 抗体が共有結合で固定化されており、穏やかな条件での溶出手順では不活性化されないため、多くの場合にレジンを複数回使用可能
• 便利なサンプル処理 — スピンカラム（寸法を参照）によってレジン損失をなくし、溶液の効率的な分離を実現
• キット一式 — 50回以上の抗体固定化およびIP実験を実施するために、細胞溶解バッファーと十分な試薬およびスピンカラムをパッケージ化
• 精製抗体が必要 — IP抗体溶液がBSAやゼラチンなどの安定化剤を含有しないこと（これらのタンパク質を簡単に除去するには、当社の抗体クリーンアップキット（製品番号44600）を参照）

アプリケーション：
• 質量分析またはシーケンシング同定分析用の免疫沈降に続くタンパク質の電気泳動と切除
• 分子量が重鎖または軽鎖抗体フラグメントと類似している標的タンパク質の免疫沈降およびSDS-PAGE分析
• 非変性法（SDS-PAGEを含まない方法）による後続の分析用の標的タンパク質の免疫沈降
• 血清や他のサンプルからのProtein A、Protein G、またはProtein A/Gに結合しない抗体による免疫沈降
• 免疫グロブリン含有血清などのサンプルからの免疫沈降

二つの簡単なステップによる直接的な免疫沈降：

ステップ1：抗体をアガロースレジンに結合：直接IP法の最初のステップは、IP抗体アフィニティーレジンを調製することです。純粋抗体（特長を参照）は、アルデヒド活性化アガロースビーズレジンである適量のAminoLink Plusカップリングレジンを使用して、リン酸塩バッファー中でインキュベートされます。インキュベーション中、大きな抗体分子の表面にあるさまざまなリジン側鎖イプシロン-アミンが、レジン上のアルデヒド基と反応してシッフ塩基結合を形成し、シアノ水素化ホウ素の存在下、安定な二級アミン結合を形成します。還元的アミノ化と呼ばれる固定化反応は非変性的であり、抗原結合能の損失を最小限に抑えつつ、通常は85%超の抗体結合効率を実現します。

ステップ2：免疫沈降実験の実施：調製した抗体レジンは、分注して並列処理することも、全体をIP実験で使用することもできます。抗体を固定化したレジンは、目的のタンパク質抗原を含むサンプルとインキュベートして、抗体-抗原複合体を形成させます。洗浄し、サンプルから非結合の（おそらく望ましくない）成分を除去した後、キットに含まれている溶出バッファーを使用して抗体から解離することにより、抗原を回収できます。手順全体をマイクロ遠心分離機スピンカップで行うため、遠心分離を短時間行うだけで、溶液をアガロースレジンから完全に分離できます。この手順によって抗原だけが溶出するため、抗体フラグメントによる干渉を受けることなく、抗原を同定してさらに解析することができます。また、抗体レジンは以降の免疫沈降に再利用できます。

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