TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit

Ambion™ TaqMan PreAmp Cells-to-C_Tキットを使用すると、RNA精製を行わずに、限られた数または少数の培養細胞から直接遺伝子発現解析を行うことができます。プロトコルには、逆転写とリアルタイムPCRの間に中間増幅ステップ（前増幅）が含まれており、このステップでは、増幅バイアスを入れずにお客様が選択した100個の遺伝子ターゲットまでcDNAが濃縮されます。

•完全な検証済みのソリューション—最適化されたワークフローには、細胞溶解試薬、DNase、RT試薬、PreAmp試薬、およびTaqMan™遺伝子発現マスターミックスが含まれます
• 高速、簡便、便利—7分でサンプルを調製でき、面倒なRNAの単離が不要です
• 限られたサンプルを拡張—リアルタイムPCRの機会を最大で64倍に増やし、同時に最大100個の遺伝子を研究できます
• 正確な結果—バイアスを入れずに均一に増幅
• 堅牢な性能—10～100,000細胞を直線的に検出。精製RNAに匹敵する結果

完全な検証済みのソリューション

ゲノムDNAを除去しRNAの完全性を維持しながら培養細胞を溶解する独自の方法を特徴とします。TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットには、cDNA合成用の逆転写（RT）試薬、最大100個の遺伝子ターゲットを前増幅するTaqMan™ PreAmpマスターミックス、およびリアルタイムPCR解析用のTaqMan™遺伝子発現マスターミックスが含まれています。

シンプルで便利な7分間のサンプル調製

TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットには、シンプルな7分サンプル調製手順（図1）が含まれており、10–100,000個の培養細胞⁄サンプルに使用できます。細胞をPBSで洗浄後、室温で5分間、溶液に溶解します。DNase処理も同時に行われます。溶解は室温にて停止液を用い、2分間のインキュベーションで終了します。

これでライセートは、逆転写や–20℃での保存の準備が整いました。サンプルは培養プレート（96または384ウェル）上で直接処理できるため、サンプル操作回数やサンプルロスあるいは移し替えによるエラーの可能性が最小限に抑えられ、限られたサンプルを拡張して使用できます。加熱、洗浄、遠心分離は必要ありません。このキットは、従来の時間と労力を要するプロセスを大幅に簡略化し、7分に短縮しています。

限られたサンプルを拡張—リアルタイムPCRの機会を最大で64倍に増やせます

Cells-to-C_T™テクノロジーと前増幅性能を統合することで、マルチステップワークフローを効率化すると同時に、貴重なサンプルから得られるPCR反応数を大幅に（60倍超）増やし、少量のサンプルインプットからmRNAを検出する感度を高められます。

遺伝子発現解析用の標準的なリアルタイムPCR反応は、ランダムプライマーとオリゴdTを用いてトータルRNAをcDNAへ逆転写することから始まり、次に遺伝子特異的プライマーとプローブを用いてリアルタイムPCRを実施します（図2）。TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットを使用すると、逆転写とリアルタイムPCRの間の中間増幅ステップ（前増幅）が実行され、増幅バイアスを入れずにお客様が選択した100個の遺伝子ターゲットまでcDNAを濃縮できます。得られた前増幅反応物は希釈され、キットに含まれるTaqMan™遺伝子発現マスターミックスを使用する次の各TaqMan™遺伝子発現アッセイの開始材料として使用できます。TaqMan™ PreAmpプロセスは、サンプルを64倍まで効率的に拡張し、限られたサンプル材料では不可能であった分析を可能にします。

正確な結果—バイアスを入れずに均一に増幅

信頼性の高い均一な前増幅を行う機能は、限られたサンプルからの遺伝子発現解析に不可欠です。RNAやcDNAを事前増幅する方法は他にもありますが、それらは出発物質を増幅するために非特異的プライミングを使用しているため、一部の転写物に他の転写物よりもバイアスがかかり、不正確に増幅されてしまいます。TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kitの一部であるTaqMan™ PreAmpマスターミックスであれば、遺伝子特異的プライマーを使用することにより、cDNAを事前増幅し、バイアスのない増幅が可能です。TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットは、100種類の各種のTaqMan遺伝子発現アッセイと比較した場合、精製RNAと同等のバイアスのない事前増幅を実現します。図3に示すとおり、事前増幅反応は、Cells-to-C_T™ライセートや精製サンプルからのバイアスが生じません；このアッセイの≥92%では、精製RNA（A）またはCells-to-C_T™キットライセート（B）からの事前増幅されたcDNAと増幅されていないcDNAを比較した場合、+⁄- 1.5 ΔΔ CT以内でした。

堅牢な性能—精製RNAに相当する結果
TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットの性能は、100種類のTaqMan™アッセイを用いて評価され、Cells-to-C_T™ライセートまたは精製RNAを用い、事前増幅を行う場合と行わない場合で評価されています。図4に示すとおり、TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットライセートで得られたCT値は、事前増幅前（A）または後（B）後に精製RNAから得られた場合と同程度にあり、ほとんどの場合、当キットにおいて良好な結果が示されています。TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットライセートの優れた性能は、加熱、転写、またはマトリックスへの吸着による損失を生じることなく、開始時サンプル中のRNAが保存されることから得られます。

10～100,000の細胞による直線性の検出

RNAプロファイリングのワークフローの各ステップは、少数または多数の細胞から機能を発揮できるよう頑強性が求められます。TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットは、溶解反応あたり10～100,000の細胞に基づいて、細胞インプットの5 logにわたって効率的に直線性が生成されるよう最適化されています（図5）。さらに、TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットでは、感度を最大化するために、RT反応液量の最大45%をサンプルライセートで構成することが可能です。TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットは、RT反応で使用される大量のライセート、最適化されたRT反応条件、リアルタイムPCR前のサンプル事前増幅などから最大の感度をもたらします。

実証済みの性能

TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットのコンポーネントは、いずれも一貫した信頼性の高い性能が得られるように最適化されています。これにより、個々のサンプル調製、RT、事前増幅、およびリアルタイムPCR用のキットを組み合わせる際の勘に頼る作業はなくなります。品質保証を強化するため、TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™キットはTaqMan™遺伝子発現アッセイを用いて検証されています。