HotStart-IT Binding Protein

アプリケーション
ホットスタートPCR増幅

HotStart-IT™結合タンパク質は、プライマー隔離と呼ばれる新しいホットスタート技術の活性成分です。一般的に、ホットスタートPCR法は、PCR反応のアセンブリ時に低温で形成される非特異的プライマー伸長産物を低減または除去します。このような比較的厳しいアニーリング温度では、プライマーが非特異的に結合することがあり、多くの場合、不要な増幅産物やプライマーダイマーにつながります。この問題を解決するために、当社では、高品質のDNA結合タンパク質を製造しました。これは、プライマーを低温で隔離してポリメラーゼで使用できないようにするのに特に役立ちます（図1）。このプライマー隔離技術は、低温でのミスプライミングイベントからDNA合成を効果的にブロックします。PCR中の初期変性ステップの後、タンパク質は不活性化され、プライマーは増幅反応に自由に参加できます。抗体や化学修飾などの他のホットスタート法とは異なり、結合タンパク質はさまざまな耐熱性ポリメラーゼに適合します。HotStart-IT結合タンパク質は、きわめて高い特異性と感度を必要とするPCRアプリケーション用に設計されており、純度と性能について徹底的に試験されています。

特性
HotStart-IT結合タンパク質は、多くの標準的なPCR反応バッファーで優れた性能を発揮します。

純度
検出可能な非特異的ヌクレアーゼを含みません。

保存バッファー
20 mMトリス-HCl（pH 8.5）、200 mM KCl、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、および50%グリセロール。

質量の定義
一般的に、1マイクログラムのHotStart-IT結合タンパク質は約5 pmolのプライマーを隔離します。

濃度
10 ± 0.5 mg/mL

由来
大腸菌で発現した組み換えタンパク質

HotStart-ITの利点
• 室温反応セットアップ
• 高い特異性と感度
• 非特異的産物やプライマーダイマーの増幅を最小限に抑制（図2）
• 複雑なテンプレートやマルチプレックス反応に最適
• 化学修飾されたTaqとは異なり、貴重なサンプルを損傷する可能性のある広範な加熱手順は不要
•技術は選択したポリメラーゼに移植可能です。

品質管理ポリメラーゼブロッキングアッセイ
このアッセイは、2 µgのHotStart-IT結合タンパク質を含むTaq DNAポリメラーゼ活性の量を、結合タンパク質を含まない活性と比較します。反応混合液には、0.625ユニットのポリメラーゼ、1倍PCR反応バッファー（10 mMトリス-HCl［pH 8.6］、50 mM KCl、1.5 mM MgCl₂）、それぞれ0.2 mMのdNTP、および25 µLの反応量で2 pmolのオーバーラップ可能な伸長性オリゴヌクレオチドが含まれます。HotStart-IT結合タンパク質は、25℃で4時間インキュベーションした後、Taq DNAポリメラーゼ活性の90%以上をブロックします。（代表的なデータについては、図2を参照してください。）

機能試験
Taq DNAポリメラーゼとHotStart-IT結合タンパク質を用いたPCRは、Taq DNAポリメラーゼ単独に比べて、プライマーダイマーの産生を、1 ngのヒトゲノムDNAから306 bpの特異的ターゲットにシフトします。