Pierce™ Protein Refolding Kit

Thermo Scientific Pierceタンパク質リフォールディングキットには、封入体から変性・可溶化された組換えタンパク質についてリフォールディング条件を検討するための試薬とガイドブックが添付されています。

タンパク質リフォールディングキットの特長：

•確実 — 試験済みの条件および成分はフォールディングバッファー液としてもっとも重要かつ一般的に有益なものに限定されています
• 便利 — 3レベルのマトリックスデザインが、必要な二次最適化の量を有意に減少させ、データ統合を簡易化します
• 調整可能なマトリックスフォーマット — 目的タンパク質に合わせてリフォールディング実験をカスタマイズ可能；バッファー液成分間の既知の正負の相互作用に対応しているので、不必要な分析が減少
• 高純度の試薬 — 試薬は厳密な基準に基づいて調整されているので一貫した結果が取得可能

キットには、凝集体から変性・可溶化された組み換えタンパク質について天然の構造と機能を回復するリフォールディングの最適バッファー条件を検討するための試薬と完全な戦略が含まれます。9種類のベースリフォールディングバッファーが添付されており、タンパク質凝集抑制のための強弱の変性条件の範囲を含むマトリックスを形成します。リフォールディングされるタンパク質の種類によっては、付属の添加物を追加マトリックス因子として使用します。バッファー成分は3種類の濃度レベルで試験されており、1回の実験で広範なスペクトルのフォールディング条件に対応可能です。マトリックス条件を目的タンパク質に合わせて調整できるので、リフォールディング収量を最大化しながら試料の無駄遣いや不必要な分析を回避します。Pierce Protein Refolding Kitには、封入体の分離、可溶化および精製、リフォールディング条件の最適化、またリフォールディング収量分析の詳細に関する網羅的なリフォールディングガイドが含まれます。

注意事項：以下のセクションは、Pierce Protein Refolding Kitの開発に関して報告されている元のPreviewsの記事に基づいています。このキットは、当初「Pro-Matrix」と呼ばれていました。

Methods
Lysozymeは、4℃（8M GdnHCl）、10 mM DTT、50 mM Tris、pH 8.0（20 mg/mL）で一晩変成しました。還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、およびDTTを、マトリックスレイアウトで決定されたリフォールディング緩衝液に追加しました（表3）。すべての溶液を4°Cに平衡化しました。可溶化リゾチームをリフォールディング緩衝液に加える直前に、8M GdnHCl、50 mM Tris、pH 8.0で平衡化したタンパク質脱塩スピンカラムを使用してDTTを除去しました。次に、リゾチームを最終濃度1 mg/mLでリフォールディング緩衝液に添加しました。この添加により、0.4M GDNHClがベースリフォールディング緩衝液に供給されます。リフォールディングは4°Cで18時間実施されましたリフォールディングの収量は、Tecan(tm) SPECTRAFluor Plus Systemを使用して、EnzChek(tm)リゾチームアッセイキット（分子プローブ）でリゾチーム活性を測定することにより求めました。

結果と考察
タンパク質のリフォールディングの基本的なプロトコルでは、完全にリフォールディングしたタンパク質を生成するために、まず封入体を分離して精製し、グアニジン塩酸塩（GDNHCl）などの強力な変性剤で溶解する必要があります。その後、可溶化されたタンパク質を希釈または透析してリフォールディング緩衝液にし、変性剤の濃度を下げます。これにより、タンパク質は一次配列に含まれる情報に基づいてリフォールディングされます。最適化された条件を使用する場合、多くのタンパク質を>1 mg/mlの濃度で確実にリフォールディングできます。ただし、変性剤を除去して最適化されていないリフォールディング緩衝液に置き換えると、タンパク質凝集は再生と強く競合し、天然タンパク質の回収量は最小限に抑えられます。リフォールディング中に生じる凝集の程度は、タンパク質濃度、強い変性剤と弱い変性剤の濃度、pH、温度、redox環境によって大きく異なります。イオン強度、二価陽イオン、ポリマー、およびコファクターは、一部のタンパク質のリフォールディングを促進することもできます。

Pierce Protein Refolding Kitを用いた還元および変性リゾチームのリフォールディング結果を表3に示します。この例では、天然状態でのジスルフィド結合の存在が不明であるかのようにリゾチームを処理しました。天然リゾチームの再形成は、タンパク質リフォールディングマトリックス中に存在するもっとも低低い変性剤の濃度および高い濃度（試験番号1、2、9）で抑制されました。また、DTT（試験番号1、6、8）の存在によりリフォールディングが抑制され、リゾチームのフォールディングにおけるジスルフィド結合の再形成の重要性が示されました。この実験で回収されたリゾチームの最大の活性は、1.4M GdnHCl、0M L-アルギニン、2 mM GSHを含む試験7で達成されました：0.4 mM GSSGで、リフォールディングされている可溶化リゾチームの90%以上を表しています。