Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay は、全血から得られる血漿中のがん由来 DNA や RNA に含まれる多数のターゲットを検出するためのトータルソリューションの一部です。このアッセイキットには、試薬と 1 プールのマルチプレックス PCR 用のプライマーセットが含まれており、10-mL チューブ 1 本の全血から得られる血漿成分中のセルフリー核酸（cfTNA）からアンプリコンライブラリを調製できます。調製後のライブラリは、高度なマルチプレックスターゲット次世代シーケンシング（NGS）で解析します。

Oncomine Cell-Free Assay の利点
• 1 本のチューブの血液から、DNA と RNA 両方のアンプリコンライブラリを作製でき、SNV の検出限界はわずか0.1％
• 回収率を高めるため、アンプリコンサイズは短いセルフリー DNA に最適化
• タグシーケンス技術で、ランダムエラーの取り込みを抑え、偽陽性率を最小化
• 高度なマルチプレックス NGS 用にアッセイデザインを最適化し、サンプル当たりのシーケンス費用を低減
• 10-mL チューブの血液サンプルから結果報告まで、わずか 2 日のワークフロー；目的のライブラリ調製にかかる総時間は 4 時間のみ
•わずか5 ng からのセルフリー核酸からがんの遺伝子解析が可能
• FFPE サンプルにも対応し、コンコーダンステストも可能

• 遺伝子パネルの内容
• ホットスポット（SNVs）と短い indel：AKT1、ALK、AR、ARAF、BRAF、CHEK2、CTNNB1、DDR2、EGFR、ERBB2、ERBB3、ESR1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、GNA11、GNAQ、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、KIT、KRAS、MAP2K1、MAP2K2、MET、MTOR、NRAS、NTRK1、NTRK3、PDGFRA、PIK3CA、RAF1、RET, ROS1、SF3B1、SMAD4、SMO
• 融合遺伝子：ALK、BRAF, ERG、ETV1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、MET, NTRK1、NTRK3, RET、ROS1
• MET エキソン14 スキッピング
• コピーナンバー変異（CNV）遺伝子：CCND1、CCND2、CCND3、CDK4、CDK6、EGFR, ERBB2、FGFR1、FGFR2、FGFR3、MET、MYC
• がん抑制遺伝子：APC、FBXW7、PTEN、TP53

検出限界：
• SNV および短い indel：アレル頻度（AF）最少 0.1％の検出限界（LOD）を、感度 >80％、特異性 >98％で達成*
• TP53 の全ターゲット SNV および indel：0.5％AF（アンプリコン中の全塩基に対して）
• 融合遺伝子と MET エキソンスキッピング最少 1％の LOD を達成
• CNV ターゲット：長さ 1.4 倍の変化を検出

全血から得た血漿成分中の DNA や RNA の単離には、MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit（A36716）の使用を推奨します。

低頻度の変異検出には、Tag Sequencing Barcode Set 1-24 もしくは 25-48（Cat.Nos. A31830もしくは A31847 ) を使って、Ion S5 chip 上でシーケンスが可能。

SNV と短い indel の解析は、Torrent Suite Software 5.2 以降のバージョンをお使いください。SNV、短い indel、融合遺伝子、および CNV の解析には、Ion Reporter Software5.6（クラウドもしくはサーバーベース）が必要です。

テクノロジー
全血から得られる血漿成分中の cfDNA や cfRNA は、とても微量です。限られた量しか得られないサンプルに対して、タグシーケンシングテクノロジーは有効です。この技術は、遺伝子特有のプライマーに異なる分子タグを付加する技術です。増幅後、タグ分子はタグごとにグループ分けします。80％以上が同じ変異を持つグループを陽性と判定します。このタグテクノロジーを使うことで、ライブラリやシーケンシングプロセスでランダムエラーを起こしたグループを排除できます。

LOD が 1-5％程度の他の技術とは異なり、Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay は最少 0.1％の SNV、つまりバックグラウンドの野生型 1,000 コピーから1 コピーの変異型を検出します。0.1％ LOD 達成には、20 ng の cfTNA のインプットが必要です。より少ない量でも解析可能ですが、LOD 値（%）はインプット量に依存して高くなります。

リキッドバイプシーは、従来の固形腫瘍生検を超えるメリットを有しています：
• リキッドバイオプシーは非侵襲的なので、がんの進行をモニターするために複数回採取可能
• 従来の組織生検採取よりも低価格
• サンプルから結果までのトータル時間を短縮
• がんの不均一性をより反映

*各変異体の感度と特異性は、標準陽性コントロールサンプルと健常人から得た cfTNA を使って決定しました。