Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor™ 488 dye

EdU はDNAに化学的に取り込まれています。 そのため、サンプルを固定後、PBSを加えて4℃で一晩保存することが可能です。また、クリック反応により、Alexa Fluor® azide はEdUに共有結合で結合します。 そのため、クリック反応後も、PBS中で 4℃で一晩保存することが可能です。

この問題は Alexa Fluor® 594 azide の染色ではないと考えられます。 マウス組織には内在的なアルキンはないため、Alexa Fluor® 594 azideが結合するものはありません。 また、この染色が核染色 (DAPI) とも重ならないため、これはEdUの非特異染色とも異なります。 これは、実際には赤血球が見えています。赤血球は赤い自家蛍光をもつ一方で核を有していません。 これは完全に未標識(色素も添加していない）切片でもこれらの染色が存在するかどうか確認することで検証できます。 また、高倍率の観察で赤血球の形状も見られます。

Click-iT Plus EdU Imaging Kit では、他の検出系との互換性のため、反応バッファーをマイルドなものに変更しています。 弊社にてパラフィン包埋切片にて Click-iT Plus EdU Imaging Kit でも問題無く染色できることを確認してはおりますが、サンプルによってはバッファーの影響が出てしまった可能性があります。
通常のプロトコールで Copper Protectant を添加するステップを 100 mM 硫酸銅(II)水溶液に置き換えることで対応できます。 逆に染まりすぎることもありますので、その場合は、Copper Protectant と 硫酸銅水溶液を適度に混合してご使用ください。 　反応バッファーはマイルドではなくなり、GFPなどは消光します。 もしGFPをご使用の場合は、anti-GFPを用いた免疫染色で検出してください。

Click-iT EdU Imaging Kit では、反応バッファーに含まれていた銅イオンによって、GFPやR-PEが消光するなど、他の検出系との互換性の問題がありました。 Click-iT Plus EdU Imaging Kit では、銅イオンにキレート剤を付加することにより他の物質への影響を減少させました。 それに伴い、今までの Alexa Fluor azide を Alexa Fluor picolyl azide という物質に変更することで、クリック反応そのものの効率が落ちないようにしています。　Click-iT Plus EdU Flow Kit につきましても同様です。

Alexa Fluor 488 has fluorescence excitation and emission maxima of 495/519 nm.

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