LiveBLAzer™ FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM

バックグラウンド：
GeneBLAzer™細胞ベースのアッセイでは、負電荷を持つ蛍光βラクタマーゼ基質、CCF2およびCCF4の膜透過性エステル型（CCF2-AMおよびCCF4-AM）を使用します。これらの親油性エステルは細胞内に容易に入り、内因性細胞質エステラーゼによる開裂により、親油性エステルが急速に負電荷を持つ形態に変換されるため、細胞内に閉じ込められます。

GeneBLAzer™アッセイの検出はFRETベースです。各基質は、効率的なFRETペアを形成する2つのフルオロフォアで標識されています。βラクタマーゼ活性が存在しない場合、インタクトなCCF2分子中のクマリンを409 nmで励起すると、フルオレセインにFRETが生じ、518 nmの緑色蛍光シグナルが放出されます（図1）。しかし、βラクタマーゼ活性の存在下では、CCF2が切断されて空間的に2つの色素が分離され、FRETが破壊されるため、409 nmでのクマリンの励起により447 nmの青色蛍光シグナルが生成されます。この青色の信号は顕微鏡下で簡単に観察でき、蛍光
マイクロプレートリーダー上で青色チャネルリードアウトの増加としても検出できます。

CCF2-AMおよびCCF4-AM基質は、GeneBLAzer™プラットフォームに不可欠なアッセイコンポーネントです。これらの基質はフローサイトメトリーと完全に互換性があるため、クローニング選択にかかる時間が短縮されます。青と緑の信号のレシオメトリック分析は、細胞数と基質負荷の違いによるウェル間の変動を低減し、Z´係数値が高く、変動係数（CV）が低くなります。

CCF2-AMとCCF4-AMは、クマリンの部分をラクタム環に連結するブリッジ内の2つのカーボンによって異なります。どちらも膜透過性のエステル化された形態であり、インタクト細胞のアッセイに使用できます。CCFX4-AMはCCF2-AMよりも溶解性が高く（>24時間可溶性）、スクリーニングアプリケーションに最適です。さらに、CCF4-AMはCCF2-AMよりもわずかに優れたFRETを有しており、CCF2-AMよりもバックグラウンドがわずかに低くなります。

CCF2-FAは、基本的に、AMバージョンに見られるエステルを含まないCCF2基質です。CCF2-FAは脱エステル化されており、細胞ライセ―トアプリケーションで使用され、細胞膜全体への負荷や脱エステル化ステップを省略します。細胞溶解物は、細胞壁を含む細胞を使用するアプリケーションでは、好ましい方法です。CCF2-FAは、CCF2-AMおよびCCF4-AMの励起スペクトルおよび発光スペクトルを取得するためのコントロールとしても使用できます。