Multi-Copy Pichia Expression Kit

次のプロトコールがPichia pastorisで良く使用されています。250 mLの培養液を使用しますが、1 mLまでスケールダウン可能です。

1. 10 mL YPD培地にPichiaを植菌し、30℃で一晩振騰培養してください。
2. 翌朝、OD600を測定してください。午後にログフェーズになるように培養液を希釈してください（午後4-5時位にDO600 = 3.0が目安）。
3. OD600が約3.0になったら、250 μL培養液を250 mL YPDに植え継いでください。翌朝元気なログフェーズにあるOD600 = 1.0付近の細胞を準備することが目的です。
4. OD600が約1.0になったら、1 L遠心管で、3,000 x gで10分間遠心分離してください。
5. やさしく250 mLの冷やした蒸留水に細胞を再懸濁してください。
6. 500 mLの遠心管に移し、3,000 x g、10分の条件で再度遠心分離してください。
7. 20 mLの冷やした1 Mソルビトール溶液に再懸濁し、50 mLのチューブに移してください。
8. 3,000 x g、10分間遠心分離してください。
9. 1 mLの1 Mソルビトール溶液に再懸濁し、氷上で保持してください。
10. 上記80 μLを1回のエレクトロポレーションに使用してください。

抗生物質の使用はお薦めできません。少なくともアンピシリン、カナマイシンの添加により発酵過程に問題が生じることはありませんが、発酵時にpHが低下するため抗生物質は不活化されます。最も優れた方法は無菌操作を確実に行う事です。

通常酸によるpH調整の必要はありません。発酵過程で培地は酸性化する傾向があります。一方、培地のpHが上昇した場合は、炭素源の枯渇、健康状態の悪化が予測されます。

Pichia発酵における窒素源はpH調整に使用される水酸化アンモニウムです。発酵に使用される基礎培地、無機塩類には窒素源は含まれません。

弊社製品（catalog # Q30007）をご利用いただく場合、それぞれのNB、S. cerevisiae用の1 L 10X YNBを調製可能です（Pichia培地用はS. cerevisiae用の2倍濃度です）。以下は1X YNBの組成です:

Ammonium Sulfate................. 5 g
Biotin....................... 0.002 mg
Calcium Pantothenate........... 0.4 mg
Folic Acid................... 0.002 mg
Inositol......................... 2 mg
Niacin......................... 0.4 mg
p-Aminobenzoic acid............ 0.2 mg
Pyridoxine HCl................. 0.4 mg
Riboflavin..................... 0.2 mg
Thiamine HCl................... 0.4 mg
Boric Acid..................... 0.5 mg
Copper Sulfate.................0.04 mg
Potassium Iodide............... 0.1 mg
Ferric Chloride................ 0.2 mg
Magnesium Sulfate.............. 0.4 mg
Sodium Molybdate............... 0.2 mg
Zinc Sulfate................... 0.4 mg
Potassium Phosphate Monobasic...1 g
Magnesium Sulfate.............. 0.5 g
Sodium Chloride................ 0.1 g
Calcium Chloride............... 0.1 g