pENTR™/TEV/D-TOPO™ Cloning Kit, with One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli

Invitrogen™

pENTR™/TEV/D-TOPO™ Cloning Kit, with One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli

製品番号（カタログ番号）	数量
K252520	20反応

製品番号（カタログ番号） K252520

価格（JPY）

146,500

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pENTR™/TEV/D-TOPO™クローニングキットは、高効率の5分間クローニング戦略（「TOPO™クローニング」）を利用して、平滑末端PCR産物をベクターに一方向にクローニングし、Gateway™ SystemまたはMultiSite Gateway™ Systemにエントリーします。平滑末端PCR産物は、pENTR™/TEV/D-TOPO™エントリーベクターに90 %以上の効率で直接クローニングされ、発現したタンパク質からN末端タグを除去するためのTEVプロテアーゼ依存切断部位を含みます。

このキットには、目的のPCR増幅遺伝子をクローニングおよび選択するために必要なすべてのものが付属しています。

• Gateway™システム対応 - クローニングされた遺伝子を複数のベクターシステム間で迅速に移動できます
• 迅速で使いやすい -PCRからGateway™ Entryクローンへ、わずか3ステップ、約5分のハンズオンタイムで移行します。
• 効率的 -正しい方向への正しい挿入で、90%を超えるクローンを実現します
• 実証済み -10年以上にわたる信頼性の高いパフォーマンス

pENTR™/TEV/D-TOPO™クローニングキットの概要

ベクター	pENTR™/TEV/D-TOPO™ベクター	N 末端タグを除去するためのTEV切断部位で最適化された、Gateway™ Systemにエントリーするための特定部位クローニングベクター
クローニング法	Directional TOPO™クローニング	平滑末端のプルーフリーディング活性を有するポリメラーゼ増幅PCR産物に対して、トポイソメラーゼIベースの約5分間の方向性ライゲーションを行い、ベクターに挿入します
コンピテントセル	2つのオプション	高効率または急速に増殖するコンピテントセルのいずれかのキットからお選びください

Gateway™ Systemへのシンプルなアクセス
Gateway Systemにアクセスするために、PCRは目的の遺伝子を増幅し、提供されたトポイソメラーゼ荷電pENTR™/SD/D-TOPO™ベクターに直接製品を追加し、5分間インキュベートして、提供されたコンピテント大腸菌細胞を形質転換します。Gateway™ Entryクローンを含むattLは、お客様が選択したGateway™デスティネーションベクターと効率的に組換えを行える状態になっています。

最適化されたpENTR™/TEV/D-TOPO™ベクター
pENTR™/TEV/D-TOPO™ベクターには、組換えタンパク質からのN末端タグのプロテアーゼ依存切断のためにタバコエッチウイルス（TEV）認識部位が含まれますこのベクターには、M13およびT7プライマーシーケンシング部位と、PCR産物の挿入部位に隣接するattL組換え部位が含まれています。これにより、クローンを簡単に配列検証し、Gateway™デスティネーションベクターを含む選択したattRへの組換えを行えます。カナマイシン耐性遺伝子とpUC起源は、大腸菌の選択および高コピー増殖に使用されます。

簡素化された特定部位クローニングベクター
Directional TOPO™クローニングテクノロジーでは、PCRクリーンアップ、ベクター調製、その他の時間のかかるDNA操作ステップが不要です。提供されたトポイソメラーゼ荷電ベクターに直接PCR反応を追加し5分間インキュベートして形質転換すると、最大90 %ので一方向に挿入されたクローンが得られます。トポイソメラーゼライゲーション反応に対する方向性をもたらすためにPCR反応で使用するフォワードプライマーに設計された4つの塩基配列を持つベクターペアの4つのベースオーバーハング（図2）。

Gateway™組換えクローニングテクノロジーの威力
Gateway™組換えクローニングテクノロジーでは、制限があるクローニングの限界を回避し、99 %効率的で可逆的なGateway™組換え反応により、ほぼすべての発現システムに1時間でアクセスできます。制限酵素、リガーゼ、サブクローニングステップ、無数のコロニーのスクリーニング、またはリシーケンシングを使用することなく、さまざまなベクター間で同じDNAの配列を移動し、時間、コスト、労力を節約します。

最先端のクローニングテクノロジー
クローニングに関しては、TOPO™クローニングテクノロジーとGateway™組換えクローニングテクノロジーが10年以上にわたり、数千人の科学者にとって信頼できるパートナーとなっています。迅速で使いやすく、効率的なTOPO™クローニングとGateway™組み換えにより、迅速なクローニングと、Gateway™発現ベクターの幅広い種類間での遺伝子の転写が可能になります。

キットオプション
pENTR™/TEV/D-TOPO™クローニングキットは、標準クローニング用のTOP10コンピテントセルまたは高速増殖用のMach1™-T1Rコンピテントセルのいずれかとともに購入できます。

研究用途にのみ使用できます。動物またはヒトの治療または診断用途には使用できません。

研究用にのみ使用できます。診断用には使用いただけません。

仕様

クローニング法Directional TOPO™

反応数20 reactions

製品ラインOne Shot

製品タイプTOPO Cloning Kit

タンパク質タグN-末端

数量20反応

ベクターpENTR

Unit SizeEach

組成および保存条件

pENTR™⁄TEV⁄D-TOPO™クローニングキットには、pENTR⁄TEV⁄D-TOPO™ベクター、dNTP、塩溶液、滅菌水、ユニバーサルM13シーケンシングプライマー、OneShot™ TOP10ケミカル大腸菌、S.O.C.培地、およびpUC19コントロールプラスミド。コンピテント大腸菌を-80℃で保管してください。その他のすべての成分を-20°℃で保管してください。

よくあるご質問（FAQ）

Your Gateway-adapted TOPO vectors are supplied with a control template and control primers. Can I obtain the sequence of the control template?

The sequence of the control template is proprietary.

I am using a Directional TOPO Cloning vector for cloning my PCR product. I have screened a bunch of colonies but they all contain my insert cloned in the reverse direction. How can I solve this problem?

Here are possible causes and suggestions:

- Incorrect PCR primer design: Make sure that the forward PCR primer contains the sequence, CACC, at the 5' end. The 4 nucleotides, CACC, base pair with the overhang sequence, GTGG, in the Directional TOPO vector.
- Reverse PCR primer is complementary to the GTGG overhang at the 5' end: Make sure that the reverse PCR primer does not contain the sequence, CACC, at the 5' end.
- Use a thermostable, proofreading polymerase such as Accuprime Pfx DNA Polymerase (Cat. No. 12344024) to produce blunt-end PCR products.

What is the best molar ratio of PCR product:vector to use for TOPO TA cloning? Is there an equation to calculate the quantity to use?

We suggest starting with a molar ratio of 1:1 (insert:vector), with a range of 0.5:1 to 2:1. The quantity used in a TOPO cloning reaction is typically 5-10 ng of a 2 kb PCR product.

Equation:

length of insert (bp)/length of vector (bp) x ng of vector = ng of insert needed for 1:1 (insert:vector ratio)

What is the best ratio of insert:vector to use for cloning? Is there an equation to calculate this?

The optimal ratio is 1:1 insert to vector. Optimization can be done using a ratio of 0.5-2 molecules of insert for every molecule of the vector.

Equation:

length of insert (bp)/length of vector (bp) x ng of vector = ng of insert needed for 1:1 insert:vector ratio

How large of a PCR product can I recombine with a pDONR vector via BP cloning? Does the same apply for TOPO-adapted Entry vectors?

There is no theoretical limit to insert size for a BP reaction with a pDONR vector. Maximum size tested in-house is 12 kb. TOPO vectors are more sensitive to insert size and 3-5 kb is the upper limit for decent cloning efficiency.

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