Zero Blunt™ PCR Cloning Kit
Zero Blunt™ PCR Cloning Kit
Citations & References (18)
Invitrogen™

Zero Blunt™ PCR Cloning Kit

Zero Blunt™ PCR Cloning Kitは、プルーフリーディング、耐熱性DNAポリメラーゼで増幅された平滑末端PCR産物の高効率（>80%）クローニングの簡単な方法を提供します。Zero詳細を見る
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製品番号（カタログ番号）数量
K27002020反応
K27004040反応
製品番号（カタログ番号） K270020
価格（JPY）
122,200
Each
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数量:
20反応
Zero Blunt™ PCR Cloning Kitは、プルーフリーディング、耐熱性DNAポリメラーゼで増幅された平滑末端PCR産物の高効率（>80%）クローニングの簡単な方法を提供します。Zero Blunt™ PCRクローニングキットは、多目的クローニングベクターpCR™-BluntおよびExpressLink™ T4 DNA Ligaseを使用して、5分間の室温ライゲーションステップでライゲーション産物を生成します。

pCR™-Bluntベクターを使用したZero Blunt™クローニング™キットの特長：
•迅速＆便利—5分間の、室温でのライゲーション
• 効率的ポジティブセレクション用のccdB遺伝子は、正しいインサートのクローンを >80％生成します
• 柔軟性カナマイシンまたはZeocin™耐性を選択できるため、抗生物質を柔軟に選択できます

The pCR™-Bluntベクターは次のものを提供します：
•インサートを切り出すための、PCR産物の挿入部位に隣接するEcoR I部位
• in vitro RNA転写およびシーケンシング用のT7プロモーター／プライマー領域
• シーケンシングまたはPCRスクリーニング用のM13フォワードおよびリバースプライマー領域

Zero Blunt™ PCRクローニングの仕組み
Zero Blunt™PCRクローニングキットは、非組み換え体のバックグラウンドが低い平滑PCRフラグメント（または平滑DNAフラグメント）をクローニングするように設計されています。pCR™-Bluntベクターには、LacZαのC末端に融合した致死的な大腸菌ccdB遺伝子が含まれています（Bernard他、1994）。平滑なPCR断片のライゲーションは、形質転換時に陽性組み換え体のみを増殖させるlacZα-ccdB遺伝子融合の発現を阻害します。非組換えベクターを含む細胞は、形質転換混合物をプレーティングする際に死滅します。

キットの構成
Zero Blunt™ PCRクローニングキットにはさまざま構成があります：One Shotあり™ TOPO10化学的コンピテント大腸菌（K2700-20およびK2700-40）、コンピテント細胞なし（K2750-20およびK2750-40）、20反応と40反応のキットサイズがあります。
研究用にのみ使用できます。診断用には使用いただけません。
仕様
菌株または酵母株TOP10
クローニング法Blunt PCR
製品ラインZero Blunt
製品タイプPCRクローニングキット
プロモーターT7
数量20反応
ベクターBlunt DNA クローニングベクター
フォーマットキット
Unit SizeEach
組成および保存条件
Zero Blunt™ PCRクローニングキットには、線形化 pCR™-Bluntベクター、ExpressLink™ T4 DNAリガーゼ、5X ExpressLink™ T4 DNA リガーゼバッファー、コントロールテンプレート、dNTP、滅菌水、およびM13フォワードおよびリバースプライマーが含まれています。コンピテントセルキット™には、One Shotケミカルコンピテント 大腸菌、S.O.C.培地、およびスーパーコイルコントロールプラスミドが含まれています。

One Shot™大腸菌を-80℃で保管してください。その他のすべての成分を-20°℃で保管してください。すべての試薬は、適切な保管条件であれば、6カ月間安定していることが保証されています。

よくあるご質問（FAQ）

What is the best molar ratio of PCR product:vector to use for TOPO TA cloning? Is there an equation to calculate the quantity to use?

We suggest starting with a molar ratio of 1:1 (insert:vector), with a range of 0.5:1 to 2:1. The quantity used in a TOPO cloning reaction is typically 5-10 ng of a 2 kb PCR product.

Equation:

length of insert (bp)/length of vector (bp) x ng of vector = ng of insert needed for 1:1 (insert:vector ratio)

What is the best ratio of insert:vector to use for cloning? Is there an equation to calculate this?

The optimal ratio is 1:1 insert to vector. Optimization can be done using a ratio of 0.5-2 molecules of insert for every molecule of the vector.

Equation:

length of insert (bp)/length of vector (bp) x ng of vector = ng of insert needed for 1:1 insert:vector ratio

I'm seeing a lot of vector-only colonies when I try to perform a negative control reaction using vector only (no insert) for a TOPO reaction. Is my TOPO vector re-ligating?

Using the vector only for transformation is not a recommended negative control. The process of TOPO-adaptation is not a 100% process, therefore, there will be “vector only” present in your mix, and colonies will be obtained.

I'm trying to clone in my phosphorylated PCR product into a TOPO vector, and I'm getting no colonies. However, when I clone the same product into a TA vector, everything works perfectly. Why is this?

Phosphorylated products can be TA cloned but not TOPO cloned. This is because the necessary phosphate group is contained within the topoisomerase-DNA intermediate complex of the vector. TOPO vectors have a 3' phosphate to which topoisomerase is covalently bound and a 5' phosphate. Non-TOPO linear vectors (TA and Blunt) have a 3' OH and a 5' phosphate. Phosphorylated products should be phosphatased (CIP) before TOPO cloning.

I'm able to get a lot of colonies, however, none contain my insert of interest. What should I do?

You may be cloning in an artifact. TA and TOPO Cloning are very efficient for small fragments (< 100 bp) present in certain PCR reactions. Gel-purify your PCR product using either a silica-based DNA purification system or electroelution. Be sure that all solutions are free of nucleases (avoid communal ethidium bromide baths, for example.)

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引用および参考文献 (18)

引用および参考文献
Abstract
Utilization of MHC class I transgenic mice for development of minigene DNA vaccinesencoding multiple HLA-restricted CTL epitopes.
Authors:Ishioka GY, Fikes J, Hermanson G, Livingston B, Crimi C, Qin M, del Guercio MF, Oseroff C, Dahlberg C, Alexander J, Chesnut RW, Sette A
Journal:J Immunol
PubMed ID:10201910
'We engineered a multiepitope DNA minigene encoding nine dominant HLA-A2.1- and A11-restricted epitopes from the polymerase, envelope, and core proteins of hepatitis B virus and HIV, together with the PADRE (pan-DR epitope) universal Th cell epitope and an endoplasmic reticulum-translocating signal sequence. Immunization of HLA transgenic mice with this construct ... More
Interactions between protein kinase CK2 and Pin1. Evidence for phosphorylation-dependent interactions.
Authors: Messenger Moira M; Saulnier Ronald B; Gilchrist Andrew D; Diamond Phaedra; Gorbsky Gary J; Litchfield David W;
Journal:J Biol Chem
PubMed ID:11940573
'The peptidyl-prolyl isomerase Pin1 interacts in a phosphorylation-dependent manner with several proteins involved in cell cycle events. In this study, we demonstrate that Pin1 interacts with protein kinase CK2, an enzyme that generally exists in tetrameric complexes composed of two catalytic CK2 alpha and/or CK2 alpha'' subunits together with two ... More
Role of CCAA nucleotide repeats in regulation of hemoglobin and hemoglobin-haptoglobin binding protein genes of haemophilus influenzae.
Authors:Ren Z, Jin H, Whitby PW, Morton DJ, Stull TL
Journal:J Bacteriol
PubMed ID:10482534
'Haemophilus influenzae utilizes hemoglobin and hemoglobin-haptoglobin as heme sources. The H. influenzae hemoglobin- and hemoglobin-haptoglobin binding protein genes, hgpA, hgpB, and hgpC, contain lengths of tetrameric CCAA repeats. Using an hgpA-lacZ translational gene fusion, we demonstrate phase-variable expression of lacZ associated with alteration in the length of the CCAA repeat ... More
Regulation of the Bub2/Bfa1 GAP complex by Cdc5 and cell cycle checkpoints.
Authors: Hu F; Wang Y; Liu D; Li Y; Qin J; Elledge S J;
Journal:Cell
PubMed ID:11733064
'During mitosis, a ras-related GTPase (Tem1) binds GTP and activates a signal transduction pathway to allow mitotic exit. During most of the cell cycle, Tem1 function is antagonized by a GTPase-activating protein complex, Bfa1/Bub2. How the Bfa1/Bub2 complex is regulated is not well understood. We find that Polo/Cdc5 kinase acts ... More
Substantially enhanced cloning efficiency of SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) byadding a heating step to the original protocol.
Authors:Kenzelmann M, Muhlemann K
Journal:Nucleic Acids Res
PubMed ID:9889294
'The efficiency of the original SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) protocol was limited by a small average size of cloned concatemers. We describe a modification of the technique that overcomes this problem. Ligation of ditags yields concatemers of various sizes. Small concatemers may aggregate and migrate with large ones ... More
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