Zero Blunt™ PCR Cloning Kit, without competent cells
Zero Blunt™ PCR Cloning Kit, without competent cells
Invitrogen™

Zero Blunt™ PCR Cloning Kit, without competent cells

Zero Blunt™ PCR Cloning Kitは、プルーフリーディング、耐熱性DNAポリメラーゼで増幅された平滑末端PCR産物の高効率（>80%）クローニングの簡単な方法を提供します。Zero詳細を見る
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製品番号（カタログ番号）数量
K27502020反応
K27504040反応
製品番号（カタログ番号） K275020
価格（JPY）
53,200
Each
お問い合わせください ›
数量:
20反応
Zero Blunt™ PCR Cloning Kitは、プルーフリーディング、耐熱性DNAポリメラーゼで増幅された平滑末端PCR産物の高効率（>80%）クローニングの簡単な方法を提供します。Zero Blunt™ PCRクローニングキットは、多目的クローニングベクターpCR™-BluntおよびExpressLink™ T4 DNA Ligaseを使用して、5分間の室温ライゲーションステップでライゲーション産物を生成します。

pCR™-Bluntベクターを使用したZero Blunt™クローニング™キットの特長：
•迅速＆便利—5分間の、室温でのライゲーション
• 効率的ポジティブセレクション用のccdB遺伝子は、正しいインサートのクローンを >80％生成します
• 柔軟性カナマイシンまたはZeocin™耐性を選択できるため、抗生物質を柔軟に選択できます

The pCR™-Bluntベクターは次のものを提供します：
•インサートを切り出すための、PCR産物の挿入部位に隣接するEcoR I部位
• in vitro RNA転写およびシーケンシング用のT7プロモーター／プライマー領域
• シーケンシングまたはPCRスクリーニング用のM13フォワードおよびリバースプライマー領域

Zero Blunt™ PCRクローニングの仕組み
Zero Blunt™PCRクローニングキットは、非組み換え体のバックグラウンドが低い平滑PCRフラグメント（または平滑DNAフラグメント）をクローニングするように設計されています。pCR™-Bluntベクターには、LacZαのC末端に融合した致死的な大腸菌ccdB遺伝子が含まれています（Bernard他、1994）。平滑なPCR断片のライゲーションは、形質転換時に陽性組み換え体のみを増殖させるlacZα-ccdB遺伝子融合の発現を阻害します。非組換えベクターを含む細胞は、形質転換混合物をプレーティングする際に死滅します。

キットの構成
Zero Blunt™ PCRクローニングキットにはさまざま構成があります：One Shotあり™ TOPO10化学的コンピテント大腸菌（K2700-20およびK2700-40）、コンピテント細胞なし（K2750-20およびK2750-40）、20反応と40反応のキットサイズがあります。
研究用にのみ使用できます。診断用には使用いただけません。
仕様
菌株または酵母株含まれない
クローニング法Blunt PCR
製品ラインTOPO、Zero Blunt
製品タイプPCRクローニングキット
プロモーターT7
数量20反応
ベクターBlunt DNA クローニングベクター
フォーマットキット
Unit SizeEach
組成および保存条件
Zero Blunt™ PCRクローニングキットには、線形化 pCR™-Bluntベクター、ExpressLink™ T4 DNAリガーゼ、5X ExpressLink™ T4 DNA リガーゼバッファー、コントロールテンプレート、dNTP、滅菌水、およびM13フォワードおよびリバースプライマーが含まれています。

すべてのコンポーネントを-20°Cで保管してください。すべての試薬は、適切な保管条件であれば、6カ月間安定していることが保証されています。

よくあるご質問（FAQ）

What is the best molar ratio of PCR product:vector to use for TOPO TA cloning? Is there an equation to calculate the quantity to use?

We suggest starting with a molar ratio of 1:1 (insert:vector), with a range of 0.5:1 to 2:1. The quantity used in a TOPO cloning reaction is typically 5-10 ng of a 2 kb PCR product.

Equation:

length of insert (bp)/length of vector (bp) x ng of vector = ng of insert needed for 1:1 (insert:vector ratio)

What is the best ratio of insert:vector to use for cloning? Is there an equation to calculate this?

The optimal ratio is 1:1 insert to vector. Optimization can be done using a ratio of 0.5-2 molecules of insert for every molecule of the vector.

Equation:

length of insert (bp)/length of vector (bp) x ng of vector = ng of insert needed for 1:1 insert:vector ratio

I'm seeing a lot of vector-only colonies when I try to perform a negative control reaction using vector only (no insert) for a TOPO reaction. Is my TOPO vector re-ligating?

Using the vector only for transformation is not a recommended negative control. The process of TOPO-adaptation is not a 100% process, therefore, there will be “vector only” present in your mix, and colonies will be obtained.

I'm trying to clone in my phosphorylated PCR product into a TOPO vector, and I'm getting no colonies. However, when I clone the same product into a TA vector, everything works perfectly. Why is this?

Phosphorylated products can be TA cloned but not TOPO cloned. This is because the necessary phosphate group is contained within the topoisomerase-DNA intermediate complex of the vector. TOPO vectors have a 3' phosphate to which topoisomerase is covalently bound and a 5' phosphate. Non-TOPO linear vectors (TA and Blunt) have a 3' OH and a 5' phosphate. Phosphorylated products should be phosphatased (CIP) before TOPO cloning.

I'm able to get a lot of colonies, however, none contain my insert of interest. What should I do?

You may be cloning in an artifact. TA and TOPO Cloning are very efficient for small fragments (< 100 bp) present in certain PCR reactions. Gel-purify your PCR product using either a silica-based DNA purification system or electroelution. Be sure that all solutions are free of nucleases (avoid communal ethidium bromide baths, for example.)

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