Reference and Assay Standard Quantification Using Digital PCR

標準曲線を使用しないリファレンスサンプルの絶対定量

ターゲット遺伝子の量を正確に定量するには、多くの場合、リファレンス サンプルとアッセイ スタンダードの比較が必要となります。計量学において、リファレンスの標準化は特に重要です。しかし、適切なリファレンスサンプルを用意できない生物種やアプリケーションは少なくありません。従来、リアルタイム PCR を使用してリファレンスサンプルを作製しようとすると、最初のリファレンスサンプルをどのように校正するかという問題に直面します。長期的に安定性を維持し、将来のあらゆる研究に対応できるリファレンス物質を確保する必要があります。また広く一般的に使用されているスタンダードサンプルでなければ、ラボ間のデータの比較も困難です。

デジタル PCR は、目的の核酸を絶対定量することを可能にする技術です。リファレンスやスタンダードサンプルを使用せず、正確なコピー数を計測できます。デジタルPCRは、新規のリファレンスサンプルやスタンダードを校正する場合にも有用な技術です。デジタル PCRによって直接コピー数の測定したスタンダードサンプルは、絶対量によるベースラインを提供し、ラボ間のデータの比較する上で信頼性の高いデータを供給します。

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図 1. デジタル PCRでスタンダードサンプルを定量
デジタルPCRは標準曲線を使用せず精密かつ再現性の高い定量を実現します。
(A) デジタル PCR で 4 種類のスタンダードを 2 回ずつランし、1μLあたりのコピー数を測定。エラーバーの短さは、各サンプルの測定精度がきわめて高いことを証明します。
(B) サンプル 600-T について10 倍希釈系列を作成。各希釈系列のサンプルにおいて、コピー数を計測した結果、優れた相関関係(0.9991)を示し、測定精度がきわめて高いことが証明されました。

QuantStudio® 3D デジタルPCRシステムを使用した絶対定量

生体サンプルに含まれる分子の量を絶対定量によって求めることは、様々なアプリケーションで必要とされます。しかし、標準的なリアルタイム PCRでこれを実現するには、さまざまな課題を解決する必要があります。 一方、デジタルPCR は、Ct値やリファレンスサンプルに頼らず、簡単かつ精密に絶対定量を行うことができます。

参考資料