Pierce™ Kit zur Isolierung von Zelloberflächenproteinen

Das Thermo Scientific Isolierungs-Kit für Zelloberflächenproteine ist ein Komplett-Reagenziensatz für die selektive Biotinylierung und nachfolgende Aufreinigung der Oberflächenproteine von Säugetierzellen zum Ausschluss intrazellulärer Proteine.

Merkmale des Isolierungs-Kits für Zelloberflächenproteine:

• Isoliert Zelloberflächenproteine: Reduziert die Komplexität des Gesamt-Zellproteins
• Wirksame Rückgewinnung von markierten Proteinen: Spaltbares Biotin gestattet eine nahezu 100%ige Rückgewinnung der isolierten Zelloberflächenproteine
• Bequem: Alle Reagenzien werden in einem einzigen Kit, komplett mit Anleitungen für die Markierung, Zelllyse und Reinigung von Membranproteinen der Zelloberfläche, geliefert
• Western Blot-Anwendungen: In SDS-PAGE-Puffer rückgewonnene Proteine werden direkt auf Polyacrylamid-Gele aufgebracht
• Robustes System: Das Protokoll eignet sich für verschiedene Zelllinien, darunter NIH 3T3, HeLa, C6 und A431

Das Kit markiert wirksam Proteine, die offene Lysinrückstände und eine ausreichende extrazelluläre Exposition aufweisen. Das Isolierungsverfahren setzt ein zellimpermeables, spaltbares Biotinylierungs-Reagenz (Sulfo-NHS-SS-Biotin) ein, um exponierte primäre Amine der Oberflächenproteine von intakten adhärenten oder Suspensionszellen zu markieren. Anschließend werden die behandelten Zelle geerntet, einer Lyse unterzogen, und die markierten Oberflächenproteine werden der Affinitätsreinigung mit dem Thermo Scientific NeutrAvidin Agarose Resin zugeführt. Die isolierten Zelloberflächenproteine weisen eine kleine, nicht reaktive Markierung der ursprünglich markierten primären Amine auf, sind aber nicht länger biotinyliert (das Biotin bleibt an das Harz gebunden). Das Kit enthält ausreichend Reagenzien für acht Experimente, für die jeweils vier T75 Kolben mit konfluenten Zellen erforderlich sind.

Das Isolierungs-Kit für Zelloberflächenproteine wurde erfolgreich zur Markierung und Reinigung von Zelloberflächenproteinen verwendet. In einem Experiment wurden HeLa-Zellen mit oder ohne Sulfo-NHS-SS-Biotin behandelt, wobei die Zellen nach Kit-Anleitung prozessiert wurden. Die Fraktionen, einschließlich Elution, Durchfluss und Gel nach der Elution, wurden mittels Western Blot analysiert. Vier Zelloberflächenproteine wurden in der Elutionsfraktion der Zellen, die mit der Biotin-Markierung behandelt wurden, identifiziert. Diese Proteine waren der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), der insulinähnliche Wachstumsfaktor-beta-Rezeptor (IGF-1β), Integrin 1 und Integrin 5. Im Gegensatz dazu wurde keines dieser Proteine in der Elutionsfraktion der unmarkierten Zellen identifiziert; die unmarkierten Proteine wurden ausschließlich im Durchfluss gefunden. Einige Zelloberflächenproteine wurden auch in den Durchflussfraktionen der markierten Zellen gefunden. Diese Proteine wurden wahrscheinlich aufgrund von sterischer Hinderung nicht markiert. Eine vernachlässigbare Menge des aufgenommenen Proteins wurde in den Gelfraktionen nach der Elution gefunden, was auf eine fast 100%ige Wiedergewinnung aufgenommener Proteine hindeutet. Eine Spurenmenge von Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) wurde in der Elutionsfraktion aller getesteten Proben nachgewiesen, was die Spezifität der Markierung für die Zelloberfläche im Vergleich zu intrazellulären Proteinen zeigte.

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